Sa shabllon duhet t'i shtojmë reagimit tim PCR?

Edhe pse në teori, një molekulë e shabllonit do të ishte e mjaftueshme, sasi të konsiderueshme më të mëdha të ADN-së përdoren zakonisht për një PCR klasike, për shembull, deri në 1 μg ADN gjenomike të gjitarëve dhe deri në 1 pg ADN plazmide.Sasia optimale varet kryesisht nga numri i kopjeve të sekuencës së synuar, si dhe nga kompleksiteti i saj.

Nëse përdoret shumë pak shabllon, do të nevojitet një rritje përkatëse në numrin e cikleve të amplifikimit për të marrë një sasi të mjaftueshme produkti.Një polimerazë Taq që përdoret për shumicën e eksperimenteve PCR nuk ka një funksion korrigjues (aktiviteti i ekzonukleazës 3'-5');kështu, gabimet që ndodhin gjatë amplifikimit nuk mund të korrigjohen.Sa më i madh të jetë numri i cikleve, aq më i përhapur do të jetë përforcimi i produktit me të meta.Nëse, nga ana tjetër, sasia e shabllonit është shumë e lartë, probabiliteti i pjekjes së primerëve me sekuenca të tjera (jo qind për qind kompliment), si dhe formimi i dimerëve të primerit, do të rritet, gjë që do të rezultojë në amplifikimin e nënproduktet.Në shumë raste, ADN-ja izolohet nga kulturat qelizore ose nga mikroorganizmat dhe më pas përdoret si model PCR.Pas pastrimit, është e nevojshme të përcaktohet përqendrimi i ADN-së për të qenë në gjendje të përcaktojë vëllimin që kërkohet për konfigurimin e PCR.Ndërsa elektroforeza e xhelit të agarozës mund të shërbejë për të dhënë një vlerësim, kjo metodë nuk është aspak e saktë.Spektrofotometria UV-Vis është vendosur si standardi i artë për përcaktimin e sasisë së acideve nukleike;Kjo metodë e drejtpërdrejtë dhe për rrjedhojë e lehtë dhe e shpejtë mat absorbimin e kampionit në 260 nm dhe përqendrimi llogaritet me ndihmën e një faktori konvertimi.

Megjithatë, nëse përqendrimi i ADN-së është shumë i ulët (< 1 µg/mL dsDNA), ose nëse është i kontaminuar me substanca që thithin gjithashtu në intervalin 260 nm (p.sh. ARN, proteina, kripëra), kjo metodë do të arrijë kufizimet e saj.Në rastin e përqendrimeve shumë të ulëta, leximet së shpejti do të bëhen shumë të pasakta për t'u përdorur dhe kontaminimet do të çojnë në mbivlerësim (ndonjëherë të madh) të vlerës aktuale.Në këtë rast, kuantifikimi duke përdorur fluoreshencë mund të paraqesë një alternativë.Kjo teknikë bazohet në përdorimin e një ngjyre fluoreshente që lidhet në mënyrë specifike me dsDNA, vetëm kompleksi që përfshin acidin nukleik dhe boja ngacmohet nga drita, dhe më pas do të lëshojë dritë me një gjatësi vale pak më të lartë.Këtu, intensiteti i sinjalit fluoreshent është proporcional me sasinë e ADN-së, dhe për përcaktimin e përqendrimit vlerësohet në lidhje me një kurbë standarde.Përparësitë e kësaj metode qëndrojnë në specifikën e lidhjes, e cila përjashton ndikimet e jashtme të shkaktuara nga kontaminimi, si dhe në aftësinë që rezulton për të zbuluar përqendrime shumë të ulëta të ADN-së.Përshtatshmëria e secilës metodë varet kryesisht nga përqendrimi dhe pastërtia e kampionit;në shumë raste madje mund të këshillohet aplikimi i të dyja metodave paralelisht.