Embora, em teoria, uma molécula do modelo fosse suficiente, quantidades consideravelmente maiores de ADN são normalmente utilizadas para uma PCR clássica, por exemplo, até 1 µg de ADN genómico de mamífero e apenas 1 pg de ADN plasmídico.A quantidade ideal depende em grande parte do número de cópias da sequência alvo, bem como da sua complexidade.
Se for utilizado muito pouco modelo, será necessário um aumento correspondente no número de ciclos de amplificação para obter uma quantidade suficiente de produto.Uma Taq polimerase usada na maioria dos experimentos de PCR não apresenta uma função de correção (atividade de exonuclease 3′-5′);portanto, os erros que ocorrem durante a amplificação não podem ser corrigidos.Quanto maior o número de ciclos, mais prevalente será a amplificação do produto defeituoso.Se, por outro lado, a quantidade de molde for demasiado elevada, a probabilidade de os iniciadores emparelharem com outras sequências (não cem por cento complementares), bem como a formação de dímeros de iniciadores, aumentará, o que resultará na amplificação de subprodutos.Em muitos casos, o DNA é isolado de culturas celulares ou de microrganismos e posteriormente utilizado como modelo de PCR.Após a purificação, é necessário determinar a concentração do DNA para poder definir o volume necessário para a configuração da PCR.Embora a eletroforese em gel de agarose possa servir para fornecer uma estimativa, este método está longe de ser preciso.A espectrofotometria UV-Vis foi estabelecida como padrão ouro para a quantificação de ácidos nucleicos;este método direto e, portanto, fácil e rápido mede a absorvância da amostra a 260 nm, e a concentração é calculada com a ajuda de um fator de conversão.
Porém, se a concentração de DNA for muito baixa (< 1 µg/mL dsDNA), ou se estiver contaminado com substâncias que também absorvem na faixa de 260 nm (por exemplo, RNA, proteínas, sais), este método atingirá suas limitações.No caso de concentrações muito baixas, as leituras tornar-se-ão rapidamente demasiado imprecisas para serem úteis, e as contaminações levarão a uma sobrestimação (por vezes enorme) do valor real.Neste caso, a quantificação por fluorescência pode apresentar uma alternativa.Esta técnica baseia-se na utilização de um corante fluorescente que se liga especificamente ao dsDNA, apenas o complexo compreendendo o ácido nucleico e o corante é excitado pela luz e posteriormente emitirá luz com um comprimento de onda ligeiramente superior.Aqui, a intensidade do sinal fluorescente é proporcional à quantidade de DNA, e para determinar a concentração é avaliada em relação a uma curva padrão.As vantagens deste método residem na especificidade da ligação, que exclui as influências externas introduzidas pela contaminação, bem como na capacidade resultante de detectar concentrações muito baixas de DNA.A adequação de qualquer método depende principalmente da concentração e pureza da amostra;em muitos casos, pode até ser aconselhável aplicar ambos os métodos em paralelo.
Horário da postagem: 30 de novembro de 2022