Bár elméletben a templát egy molekulája elegendő lenne, a klasszikus PCR-hez jellemzően lényegesen nagyobb mennyiségű DNS-t használnak, például legfeljebb 1 µg genomiális emlős DNS-t és mindössze 1 pg plazmid DNS-t.Az optimális mennyiség nagymértékben függ a célszekvencia másolatainak számától, valamint annak összetettségétől.
Ha nagyon kevés templátot használunk, akkor az amplifikációs ciklusok számának megfelelő növelésére lesz szükség ahhoz, hogy elegendő mennyiségű terméket kapjunk.A legtöbb PCR-kísérlethez használt Taq polimeráz nem rendelkezik korrekciós funkcióval (3'-5' exonukleáz aktivitás);így az erősítés során fellépő hibák nem javíthatók.Minél nagyobb a ciklusok száma, annál gyakoribb lesz a hibás termék felerősítése.Ha viszont túl nagy a templát mennyisége, akkor megnő annak a valószínűsége, hogy a primerek más (nem száz százalékban komplementer) szekvenciákhoz kapcsolódnak, valamint a primer dimerek képződése, ami a primerek amplifikációját eredményezi. melléktermékek.Sok esetben a DNS-t sejttenyészetekből vagy mikroorganizmusokból izolálják, és ezt követően PCR-templátként használják.A tisztítást követően meg kell határozni a DNS koncentrációját, hogy meg lehessen határozni a PCR beállításához szükséges térfogatot.Míg az agaróz gél elektroforézis szolgálhat becsléshez, ez a módszer messze nem pontos.Az UV-Vis spektrofotometriát a nukleinsavak mennyiségi meghatározásának aranystandardjaként határozták meg;ez a közvetlen, ezért egyszerű és gyors módszer 260 nm-en méri a minta abszorbanciáját, és konverziós tényező segítségével számítja ki a koncentrációt.
Ha azonban a DNS koncentrációja nagyon alacsony (< 1 µg/mL dsDNS), vagy ha olyan anyagokkal szennyezett, amelyek a 260 nm-es tartományban is abszorbeálódnak (pl. RNS, fehérje, sók), akkor ez a módszer eléri korlátait.Nagyon alacsony koncentrációk esetén a leolvasások hamarosan túlságosan pontatlanok lesznek ahhoz, hogy használhatók legyenek, és a szennyeződések a tényleges érték (néha óriási) túlbecsléséhez vezetnek.Ebben az esetben a fluoreszcenciával történő mennyiségi meghatározás alternatívát jelenthet.Ez a technika egy fluoreszcens festék alkalmazásán alapul, amely specifikusan kötődik a dsDNS-hez, csak a nukleinsavat és a festéket tartalmazó komplexet gerjeszti a fény, és ezt követően valamivel nagyobb hullámhosszú fényt bocsát ki.Itt a fluoreszcens jel intenzitása arányos a DNS mennyiségével, és a koncentráció meghatározásához standard görbéhez viszonyítva értékeljük ki.Ennek a módszernek az előnyei a kötés specifitásán nyugszanak, amely kizárja a szennyeződés által bevitt külső hatásokat, valamint az ebből eredő képességen a nagyon alacsony DNS-koncentráció kimutatására.Mindkét módszer alkalmassága elsősorban a minta koncentrációjától és tisztaságától függ;sok esetben akár tanácsos is lehet mindkét módszer párhuzamos alkalmazása.
Feladás időpontja: 2022.11.30