理論上はテンプレート分子 1 つで十分ですが、古典的な PCR では通常、哺乳動物のゲノム DNA なら最大 1 μg、プラスミド DNA ならわずか 1 pg など、かなり大量の DNA が使用されます。最適な量は、ターゲット配列のコピー数とその複雑さに大きく依存します。
使用するテンプレートの量が非常に少ない場合、十分な量の産物を得るには、それに応じて増幅サイクル数を増やす必要があります。ほとんどの PCR 実験に使用される Taq ポリメラーゼには、補正機能 (3'-5' エキソヌクレアーゼ活性) がありません。したがって、増幅中に発生するエラーを修正することはできません。サイクル数が多いほど、欠陥のある生成物の増幅がより蔓延します。一方、テンプレートの量が多すぎる場合は、プライマーが他の (100% 相補的ではない) 配列にアニーリングする確率や、プライマーダイマーの形成が増加し、その結果、副産物。多くの場合、DNA は細胞培養物または微生物から単離され、その後 PCR テンプレートとして使用されます。精製後、PCR セットアップに必要な量を定義できるように DNA の濃度を決定する必要があります。アガロースゲル電気泳動は推定値を提供するのに役立ちますが、この方法は正確とは程遠いです。UV-Vis 分光測光法は、核酸定量のゴールドスタンダードとして確立されています。この直接的な方法では、サンプルの吸光度を 260 nm で測定し、変換係数を利用して濃度を計算します。
ただし、DNA 濃度が非常に低い場合 (< 1 µg/mL dsDNA)、または 260 nm 範囲でも吸収する物質 (RNA、タンパク質、塩など) で汚染されている場合、この方法は限界に達します。非常に低い濃度の場合、測定値はすぐに不正確になりすぎて役に立たなくなり、汚染により実際の値が（場合によっては非常に）過大評価されてしまいます。この場合、蛍光を使用した定量化が代替手段となる可能性があります。この技術は、dsDNA に特異的に結合する蛍光色素の使用に基づいており、核酸と色素からなる複合体のみが光によって励起され、その後わずかに高い波長の光を放射します。ここで、蛍光シグナルの強度は DNA の量に比例し、濃度を決定するには標準曲線との関係で評価されます。この方法の利点は、汚染によってもたらされる外部影響を排除する結合の特異性と、その結果得られる非常に低濃度の DNA を検出できる能力にあります。どちらの方法の適合性も、主にサンプルの濃度と純度によって決まります。多くの場合、両方の方法を並行して適用することをお勧めします。
投稿日時: 2022 年 11 月 30 日