Lai gan teorētiski pietiktu ar vienu veidnes molekulu, klasiskajam PCR parasti izmanto ievērojami lielākus DNS daudzumus, piemēram, līdz 1 µg genoma zīdītāju DNS un tikai 1 pg plazmīdas DNS.Optimālais daudzums lielā mērā ir atkarīgs no mērķa secības kopiju skaita, kā arī no tās sarežģītības.
Ja tiek izmantots ļoti maz veidnes, būs nepieciešams attiecīgi palielināt pastiprināšanas ciklu skaitu, lai iegūtu pietiekamu produkta daudzumu.Taq polimerāzei, ko izmanto lielākajā daļā PCR eksperimentu, nav korekcijas funkcijas (3′-5′ eksonukleāzes aktivitāte);tādējādi pastiprināšanas laikā radušās kļūdas nevar labot.Jo lielāks ciklu skaits, jo izplatītāka būs bojātā produkta pastiprināšana.Ja, no otras puses, veidnes daudzums ir pārāk liels, palielināsies iespējamība, ka praimeri atlaidināsies ar citām (ne simtprocentīgi komplimentējošām) sekvencēm, kā arī veidosies praimeru dimēri, kā rezultātā pastiprināsies blakusprodukti.Daudzos gadījumos DNS tiek izolēta no šūnu kultūrām vai mikroorganismiem un pēc tam izmantota kā PCR veidne.Pēc attīrīšanas ir jānosaka DNS koncentrācija, lai varētu noteikt tilpumu, kas nepieciešams PCR iestatīšanai.Lai gan agarozes gēla elektroforēze var kalpot, lai sniegtu novērtējumu, šī metode nebūt nav precīza.UV-Vis spektrofotometrija ir noteikta kā zelta standarts nukleīnskābju kvantitatīvai noteikšanai;šī tiešā un tāpēc vienkāršā un ātrā metode mēra parauga absorbciju pie 260 nm, un koncentrāciju aprēķina ar pārrēķina koeficienta palīdzību.
Tomēr, ja DNS koncentrācija ir ļoti zema (< 1 µg/mL dsDNS) vai ja tā ir piesārņota ar vielām, kas arī absorbē 260 nm diapazonā (piemēram, RNS, olbaltumvielas, sāļi), šī metode sasniegs savus ierobežojumus.Ļoti zemu koncentrāciju gadījumā rādījumi drīz kļūs pārāk neprecīzi, lai tos varētu izmantot, un piesārņojums novedīs pie (dažreiz milzīgi) faktiskās vērtības pārvērtēšanas.Šajā gadījumā alternatīva var būt kvantitatīva noteikšana, izmantojot fluorescenci.Šis paņēmiens ir balstīts uz fluorescējošas krāsas izmantošanu, kas īpaši saistās ar dsDNS, tikai gaisma ierosina kompleksu, kas satur nukleīnskābi un krāsvielu, un pēc tam tas izstaros gaismu ar nedaudz augstāku viļņa garumu.Šeit fluorescējošā signāla intensitāte ir proporcionāla DNS daudzumam, un koncentrācijas noteikšanai tā tiek novērtēta attiecībā pret standarta līkni.Šīs metodes priekšrocības balstās uz saites specifiku, kas izslēdz piesārņojuma radītās ārējās ietekmes, kā arī no tā izrietošās spējas noteikt ļoti zemas DNS koncentrācijas.Jebkuras metodes piemērotība galvenokārt ir atkarīga no parauga koncentrācijas un tīrības;daudzos gadījumos var būt pat ieteicams izmantot abas metodes paralēli.
Izlikšanas laiks: 30. novembris 2022