Sanajan dina téori, hiji molekul témplat bakal cukup, jumlah DNA anu jauh leuwih badag ilaharna dipaké pikeun PCR klasik, contona, nepi ka 1 µg DNA mamalia génomik jeung saeutikna 1 pg DNA plasmid.Jumlah optimal gumantung sakitu legana dina jumlah salinan tina runtuyan target, kitu ogé dina pajeulitna.
Lamun saeutik pisan template dipaké, bakal naek pakait dina jumlah siklus amplifikasi diperlukeun pikeun ménta jumlah cukup produk.Polimérase Taq anu dipaké pikeun kalolobaan ékspérimén PCR henteu gaduh fungsi koréksi (aktivitas exonuclease 3′-5′);sahingga, kasalahan lumangsung salila amplifikasi teu bisa dilereskeun.Nu leuwih luhur jumlah siklus, beuki kaprah amplifikasi produk flawed bakal.Upami, di sisi anu sanésna, jumlah template teuing tinggi, kamungkinan primers annealing kana urutan séjén (teu saratus persen complimentary), kitu ogé formasi dimer primer, bakal ngaronjat, nu bakal ngakibatkeun amplifikasi tina. produk sampingan.Dina sababaraha kasus, DNA diisolasi tina kultur sél atanapi tina mikroorganisme teras dianggo salaku citakan PCR.Saatos purifikasi, perlu pikeun nangtukeun konsentrasi DNA pikeun bisa nangtukeun volume anu diperlukeun pikeun setup PCR.Sanaos éléktroforésis gél agarose tiasa masihan perkiraan, metode ieu jauh tina akurat.spéktrofotometri UV-Vis geus ditetepkeun minangka standar emas pikeun kuantifikasi asam nukléat;métode langsung sahingga gampang tur gancang ieu ngukur absorbance sampel dina 260 nm, sarta konsentrasi diitung kalayan bantuan faktor konvérsi.
Lamun konsentrasi DNA handap pisan, kumaha oge (<1 µg/mL dsDNA), atawa lamun kacemar ku zat anu ogé nyerep dina rentang 260 nm (misalna RNA, protéin, uyah), métode ieu bakal ngahontal watesan na.Dina kasus konséntrasi anu handap pisan, bacaan bakal pas janten teu akurat teuing pikeun dianggo, sareng kontaminasi bakal ngakibatkeun (kadang-kadang ageung) overestimation tina nilai anu saleresna.Dina hal ieu, kuantifikasi nganggo fluoresensi tiasa janten alternatif.Téhnik ieu dumasar kana pamakean pewarna fluoresensi anu ngiket khusus ka dsDNA ngan ukur komplek anu diwangun ku asam nukléat sareng pewarna anu gumbira ku cahaya, teras bakal ngaluarkeun cahaya anu panjang gelombangna rada luhur.Di dieu, inténsitas sinyal fluoresensi sabanding jeung jumlah DNA, sarta pikeun nangtukeun konsentrasi eta dievaluasi dina hubungan kurva baku.Kaunggulan tina metoda ieu gumantung kana spésifisitas beungkeut, nu teu kaasup pangaruh éksternal diwanohkeun ku kontaminasi, kitu ogé dina kamampuhan pikeun ngadeteksi konsentrasi pisan low DNA.Kasaluyuan boh métode gumantung utamana kana konsentrasi sampel sarta purity;dina loba kasus malah bisa jadi sasaena pikeun nerapkeun duanana métode dina paralel.
waktos pos: Nov-30-2022