ما مقدار القالب الذي يجب أن نضيفه إلى تفاعل PCR الخاص بي؟

على الرغم من أن جزيءًا واحدًا من القالب سيكون كافيًا من الناحية النظرية، إلا أنه عادةً ما يتم استخدام كميات أكبر بكثير من الحمض النووي في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكلاسيكي، على سبيل المثال، ما يصل إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي للثدييات وما يصل إلى 1 بيكوغرام من الحمض النووي البلازميد.ويعتمد المقدار الأمثل إلى حد كبير على عدد نسخ التسلسل المستهدف، فضلاً عن مدى تعقيده.

إذا تم استخدام قالب قليل جدًا، ستكون هناك حاجة إلى زيادة مقابلة في عدد دورات التضخيم للحصول على كمية كافية من المنتج.لا يتميز بوليميريز طق المستخدم في معظم تجارب PCR بوظيفة التصحيح (نشاط نوكلياز خارجي 3′-5′)؛وبالتالي، لا يمكن تصحيح الأخطاء التي تحدث أثناء التضخيم.كلما زاد عدد الدورات، كلما زاد انتشار المنتج المعيب.من ناحية أخرى، إذا كانت كمية القالب مرتفعة جدًا، فإن احتمالية تصلب البادئات إلى تسلسلات أخرى (ليست مجانية بنسبة مائة بالمائة)، بالإضافة إلى تكوين ديميرات تمهيدية، ستزداد، مما سيؤدي إلى تضخيم المنتجات الثانوية.في كثير من الحالات، يتم عزل الحمض النووي من مزارع الخلايا أو من الكائنات الحية الدقيقة ويستخدم لاحقًا كقالب PCR.بعد التنقية، من الضروري تحديد تركيز الحمض النووي لتتمكن من تحديد الحجم المطلوب لإعداد PCR.في حين أن التفريد الكهربائي لهلام الاغاروز قد يعمل على تقديم تقدير، فإن هذه الطريقة بعيدة عن الدقة.تم إنشاء القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية باعتباره المعيار الذهبي لتقدير كمية الأحماض النووية؛تقيس هذه الطريقة المباشرة، وبالتالي السهلة والسريعة، امتصاص العينة عند 260 نانومتر، ويتم حساب التركيز بمساعدة عامل التحويل.

إذا كان تركيز الحمض النووي منخفضًا جدًا (<1 ميكروغرام/مل dsDNA)، أو إذا كان ملوثًا بمواد تمتص أيضًا في نطاق 260 نانومتر (مثل RNA، البروتين، الأملاح)، فإن هذه الطريقة ستصل إلى حدودها.في حالة التركيزات المنخفضة جدًا، ستصبح القراءات قريبًا غير دقيقة جدًا بحيث لا يمكن استخدامها، وستؤدي التلوثات إلى المبالغة في تقدير القيمة الفعلية (هائلة في بعض الأحيان).في هذه الحالة، القياس الكمي باستخدام مضان قد يقدم بديلا.تعتمد هذه التقنية على استخدام صبغة الفلورسنت التي ترتبط بشكل خاص بالحمض النووي المزدوج (dsDNA) فقط المعقد الذي يشتمل على الحمض النووي والصبغة يتم تحفيزه بواسطة الضوء، وسوف ينبعث بعد ذلك ضوء بطول موجي أعلى قليلاً.هنا، تتناسب شدة إشارة الفلورسنت مع كمية الحمض النووي، ولتحديد التركيز يتم تقييمه بالنسبة إلى المنحنى القياسي.تعتمد مزايا هذه الطريقة على خصوصية الرابطة، التي تستبعد التأثيرات الخارجية الناتجة عن التلوث، وكذلك على القدرة الناتجة على اكتشاف تركيزات منخفضة جدًا من الحمض النووي.مدى ملاءمة أي من الطريقتين يعتمد بشكل رئيسي على تركيز العينة والنقاء؛وفي كثير من الحالات قد يكون من المستحسن تطبيق كلتا الطريقتين بالتوازي.