Meskipun secara teori, satu molekul templat sudah cukup, jumlah DNA yang jauh lebih besar biasanya digunakan untuk PCR klasik, misalnya, hingga 1 µg DNA genom mamalia dan sedikitnya 1 pg DNA plasmid.Jumlah optimal sangat bergantung pada jumlah salinan urutan target, serta kompleksitasnya.
Jika templat yang digunakan sangat sedikit, peningkatan jumlah siklus amplifikasi akan diperlukan untuk memperoleh jumlah produk yang cukup.Polimerase Taq yang digunakan untuk sebagian besar percobaan PCR tidak memiliki fungsi koreksi (aktivitas eksonuklease 3′-5′);dengan demikian, kesalahan yang terjadi selama amplifikasi tidak dapat diperbaiki.Semakin tinggi jumlah siklus, semakin besar kemungkinan amplifikasi produk yang cacat.Sebaliknya, jika jumlah templat terlalu tinggi, kemungkinan primer teranil ke rangkaian lain (yang tidak seratus persen saling melengkapi), serta pembentukan dimer primer, akan meningkat, yang akan mengakibatkan amplifikasi produk sampingan.Dalam banyak kasus, DNA diisolasi dari kultur sel atau mikroorganisme dan selanjutnya digunakan sebagai cetakan PCR.Setelah pemurnian, konsentrasi DNA perlu ditentukan agar dapat menentukan volume yang diperlukan untuk pengaturan PCR.Meskipun elektroforesis gel agarosa dapat memberikan perkiraan, metode ini jauh dari akurat.Spektrofotometri UV-Vis telah ditetapkan sebagai standar emas untuk kuantifikasi asam nukleat;metode langsung dan mudah serta cepat ini mengukur serapan sampel pada 260 nm, dan konsentrasi dihitung dengan bantuan faktor konversi.
Namun, jika konsentrasi DNA sangat rendah (< 1 µg/mL dsDNA), atau jika terkontaminasi dengan zat yang juga menyerap dalam rentang 260 nm (misalnya RNA, protein, garam), metode ini akan mencapai keterbatasannya.Dalam kasus konsentrasi yang sangat rendah, pembacaan akan menjadi terlalu tidak akurat untuk digunakan, dan kontaminasi akan menyebabkan (terkadang sangat besar) penilaian yang berlebihan terhadap nilai sebenarnya.Dalam hal ini, kuantifikasi menggunakan fluoresensi dapat memberikan alternatif.Teknik ini didasarkan pada penggunaan pewarna fluoresen yang berikatan khusus dengan dsDNA, hanya kompleks yang terdiri dari asam nukleat dan pewarna tersebut tereksitasi oleh cahaya, dan selanjutnya akan memancarkan cahaya dengan panjang gelombang yang sedikit lebih tinggi.Di sini, intensitas sinyal fluoresen sebanding dengan jumlah DNA, dan untuk menentukan konsentrasi, sinyal tersebut dievaluasi dalam kaitannya dengan kurva standar.Keuntungan dari metode ini terletak pada kekhususan ikatan, yang menghilangkan pengaruh eksternal yang ditimbulkan oleh kontaminasi, serta kemampuan yang dihasilkan untuk mendeteksi konsentrasi DNA yang sangat rendah.Kesesuaian metode mana pun terutama bergantung pada konsentrasi dan kemurnian sampel;dalam banyak kasus bahkan mungkin disarankan untuk menerapkan kedua metode secara paralel.
Waktu posting: 30 November 2022