Čeprav bi v teoriji zadostovala že ena molekula šablone, se za klasično PCR običajno uporabijo precej večje količine DNA, na primer do 1 µg genomske DNA sesalcev in le 1 pg plazmidne DNA.Optimalna količina je v veliki meri odvisna od števila kopij ciljnega zaporedja, pa tudi od njegove kompleksnosti.
Če se uporabi zelo malo šablone, bo za pridobitev zadostne količine produkta potrebno ustrezno povečanje števila ciklov pomnoževanja.Polimeraza Taq, ki se uporablja za večino poskusov PCR, nima korekcijske funkcije (3'-5' eksonukleazna aktivnost);tako napak, ki se pojavijo med ojačanjem, ni mogoče popraviti.Večje kot je število ciklov, bolj razširjeno bo pomnoževanje izdelka z napako.Če pa je količina matrice prevelika, se poveča verjetnost žarjenja primerjev z drugimi (ne stoodstotno komplementarnimi) sekvencami ter tvorba primerjev dimerjev, kar bo povzročilo pomnoževanje stranski proizvodi.V mnogih primerih se DNK izolira iz celičnih kultur ali mikroorganizmov in se nato uporabi kot matrica za PCR.Po čiščenju je treba določiti koncentracijo DNA, da lahko določimo količino, ki je potrebna za nastavitev PCR.Čeprav lahko elektroforeza v agaroznem gelu služi kot ocena, ta metoda še zdaleč ni natančna.UV-Vis spektrofotometrija je bila uveljavljena kot zlati standard za kvantifikacijo nukleinskih kislin;ta neposredna in zato enostavna in hitra metoda meri absorbanco vzorca pri 260 nm, koncentracijo pa izračunamo s pomočjo pretvorbenega faktorja.
Če pa je koncentracija DNA zelo nizka (< 1 µg/mL dsDNA) ali če je kontaminirana s snovmi, ki absorbirajo tudi v območju 260 nm (npr. RNA, beljakovine, soli), bo ta metoda dosegla svoje omejitve.V primeru zelo nizkih koncentracij bodo odčitki kmalu postali preveč nenatančni, da bi bili uporabni, onesnaženje pa bo povzročilo (včasih enormno) precenjevanje dejanske vrednosti.V tem primeru je lahko kvantifikacija z uporabo fluorescence alternativa.Ta tehnika temelji na uporabi fluorescenčnega barvila, ki se specifično veže na dsDNA, le kompleks, ki vsebuje nukleinsko kislino in barvilo, je vzbujen s svetlobo, nato pa bo oddajal svetlobo nekoliko višje valovne dolžine.Pri tem je intenzivnost fluorescentnega signala sorazmerna s količino DNK, za določanje koncentracije pa se ovrednoti glede na standardno krivuljo.Prednosti te metode temeljijo na specifičnosti vezi, ki izključuje zunanje vplive, ki jih povzroča kontaminacija, kot tudi na posledični sposobnosti zaznavanja zelo nizkih koncentracij DNK.Primernost katere koli metode je odvisna predvsem od koncentracije in čistosti vzorca;v mnogih primerih je morda celo priporočljiva uporaba obeh metod vzporedno.
Čas objave: 30. nov. 2022