Иако теоретски, една молекула од шаблонот би била доволна, значително поголеми количини на ДНК обично се користат за класичен PCR, на пример, до 1 μg геномска ДНК на цицачи и дури 1 pg плазмидна ДНК.Оптималната количина зависи во голема мера од бројот на копии на целната низа, како и од нејзината сложеност.
Ако се користи многу малку шаблон, ќе биде потребно соодветно зголемување на бројот на циклуси на засилување за да се добие доволна количина на производ.Taq полимеразата која се користи за повеќето PCR експерименти нема функција за корекција (3'-5' егзонуклеазна активност);така, грешките што се појавуваат за време на засилувањето не можат да се поправат.Колку е поголем бројот на циклуси, толку поприсутно ќе биде засилувањето на неисправниот производ.Ако, од друга страна, количината на шаблонот е превисока, веројатноста за жарење на прајмери со други (не сто проценти комплементарни) секвенци, како и формирање на димери на прајмер, ќе се зголеми, што ќе резултира со засилување на нуспроизводи.Во многу случаи, ДНК е изолирана од клеточни култури или од микроорганизми и последователно се користи како шаблон за PCR.По прочистувањето, неопходно е да се одреди концентрацијата на ДНК за да може да се дефинира волуменот што е потребен за поставување на PCR.Додека електрофорезата со гел агароза може да послужи за давање проценка, овој метод е далеку од точен.УВ-Вис спектрофотометријата е воспоставена како златен стандард за квантификација на нуклеинските киселини;овој директен и затоа лесен и брз метод ја мери апсорпцијата на примерокот на 260 nm, а концентрацијата се пресметува со помош на фактор на конверзија.
Меѓутоа, ако концентрацијата на ДНК е многу ниска (< 1 µg/mL dsDNA), или ако е контаминирана со супстанции кои исто така апсорбираат во опсегот од 260 nm (на пр. РНК, протеини, соли), овој метод ќе ги достигне своите ограничувања.Во случај на многу ниски концентрации, отчитувањата наскоро ќе станат премногу неточни за да бидат употребливи, а контаминациите ќе доведат до (понекогаш огромно) преценување на вистинската вредност.Во овој случај, квантификацијата со помош на флуоресценција може да претставува алтернатива.Оваа техника се заснова на употреба на флуоресцентна боја која специфично се врзува за dsDNA само комплексот што содржи нуклеинска киселина и бојата е возбудена од светлината, а потоа ќе емитува светлина со малку поголема бранова должина.Овде, интензитетот на флуоресцентниот сигнал е пропорционален на количината на ДНК, а за одредување на концентрацијата се оценува во однос на стандардна крива.Предностите на овој метод се засноваат на специфичноста на врската, која ги исклучува надворешните влијанија предизвикани од контаминација, како и врз способноста што произлегува за откривање на многу ниски концентрации на ДНК.Соодветноста на кој било метод зависи главно од концентрацијата и чистотата на примерокот;во многу случаи дури може да биде препорачливо паралелно да се применуваат двата методи.
Време на објавување: 30-11-2022 година