Hoewel in theorie één molecuul van de matrijs voldoende zou zijn, worden doorgaans aanzienlijk grotere hoeveelheden DNA gebruikt voor een klassieke PCR, bijvoorbeeld tot 1 µg genomisch DNA van zoogdieren en slechts 1 pg plasmide-DNA.De optimale hoeveelheid hangt grotendeels af van het aantal kopieën van de doelsequentie, evenals van de complexiteit ervan.
Als er heel weinig template wordt gebruikt, zal een overeenkomstige toename van het aantal amplificatiecycli nodig zijn om een voldoende hoeveelheid product te verkrijgen.Een Taq-polymerase dat voor de meeste PCR-experimenten wordt gebruikt, heeft geen correctiefunctie (3'-5'-exonuclease-activiteit);fouten die optreden tijdens de versterking kunnen dus niet worden gecorrigeerd.Hoe hoger het aantal cycli, des te vaker zal de versterking van het gebrekkige product plaatsvinden.Als daarentegen de hoeveelheid template te hoog is, zal de waarschijnlijkheid dat primers aan andere (niet honderd procent complementaire) sequenties hechten, evenals de vorming van primerdimeren, toenemen, wat zal resulteren in de amplificatie van bijproducten.In veel gevallen wordt DNA geïsoleerd uit celculturen of uit micro-organismen en vervolgens gebruikt als PCR-template.Na de zuivering is het noodzakelijk om de concentratie van het DNA te bepalen om het volume te kunnen bepalen dat nodig is voor de PCR-opstelling.Hoewel agarosegelelektroforese kan dienen om een schatting te geven, is deze methode verre van nauwkeurig.UV-Vis-spectrofotometrie is vastgesteld als de gouden standaard voor de kwantificering van nucleïnezuren;deze directe en daardoor gemakkelijke en snelle methode meet de absorptie van het monster bij 260 nm, en de concentratie wordt berekend met behulp van een conversiefactor.
Als de DNA-concentratie echter erg laag is (< 1 µg/ml dsDNA), of als het verontreinigd is met stoffen die ook in het 260 nm-bereik absorberen (bijvoorbeeld RNA, eiwit, zouten), loopt deze methode tegen zijn beperkingen aan.Bij zeer lage concentraties zullen de meetwaarden al snel te onnauwkeurig worden om nog bruikbaar te zijn, en zullen verontreinigingen leiden tot (soms enorme) overschatting van de werkelijke waarde.In dit geval kan kwantificering met behulp van fluorescentie een alternatief bieden.Deze techniek is gebaseerd op het gebruik van een fluorescerende kleurstof die specifiek aan dsDNA bindt. Alleen het complex dat nucleïnezuur en kleurstof omvat, wordt door het licht aangeslagen en zal vervolgens licht met een iets hogere golflengte uitstralen.Hierbij is de intensiteit van het fluorescentiesignaal evenredig met de hoeveelheid DNA en wordt voor het bepalen van de concentratie beoordeeld aan de hand van een standaardcurve.De voordelen van deze methode berusten op de specificiteit van de binding, die de externe invloeden uitsluit die door contaminatie worden geïntroduceerd, evenals op het resulterende vermogen om zeer lage DNA-concentraties te detecteren.De geschiktheid van beide methoden hangt voornamelijk af van de monsterconcentratie en zuiverheid;in veel gevallen kan het zelfs raadzaam zijn beide methoden parallel toe te passen.
Posttijd: 30 november 2022