כמה תבנית עלינו להוסיף לתגובת ה-PCR שלי?

למרות שבתיאוריה, מולקולה אחת של התבנית תספיק, בדרך כלל נעשה שימוש בכמויות גדולות יותר של DNA עבור PCR קלאסי, למשל, עד 1 מיקרוגרם של DNA יונק גנומי ועד 1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד.הכמות האופטימלית תלויה במידה רבה במספר העותקים של רצף המטרה, כמו גם במורכבותו.

אם נעשה שימוש בתבנית מעטה מאוד, יהיה צורך בגידול מקביל במספר מחזורי ההגברה כדי להשיג כמות מספקת של מוצר.פולימראז Taq המשמש לרוב ניסויי PCR אינו כולל פונקציית תיקון (פעילות אקסונוקלאז 3'-5');לפיכך, לא ניתן לתקן שגיאות המתרחשות במהלך ההגברה.ככל שמספר המחזורים גבוה יותר, כך ההגברה של המוצר הפגום תהיה נפוצה יותר.אם, לעומת זאת, כמות התבנית גבוהה מדי, תגדל ההסתברות לחיבור של פריימרים לרצפים אחרים (לא מאה אחוז משלימים), כמו גם היווצרות של דימרי פריימר, מה שיגרום להגברה של תוצרי לוואי.במקרים רבים, DNA מבודד מתרביות תאים או ממיקרואורגניזמים ולאחר מכן משמש כתבנית PCR.לאחר טיהור, יש צורך לקבוע את ריכוז ה-DNA כדי להיות מסוגל להגדיר את הנפח הנדרש עבור הגדרת ה-PCR.בעוד אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז עשויה לשמש כדי לספק אומדן, שיטה זו רחוקה מלהיות מדויקת.ספקטרופוטומטריית UV-Vis הוקמה כסטנדרט הזהב לכימות חומצות גרעין;שיטה ישירה ולכן קלה ומהירה זו מודדת את הספיגה של המדגם ב-260 ננומטר, והריכוז מחושב בעזרת מקדם המרה.

אם ריכוז ה-DNA נמוך מאוד, לעומת זאת (< 1 µg/mL dsDNA), או אם הוא מזוהם בחומרים שסופגים גם בטווח של 260 ננומטר (למשל RNA, חלבון, מלחים), שיטה זו תגיע למגבלותיה.במקרה של ריכוזים נמוכים מאוד, הקריאות יהפכו במהרה לא מדויקות מכדי להועיל, וזיהומים יובילו להערכת יתר (לעיתים עצומה) של הערך בפועל.במקרה זה, כימות באמצעות הקרינה עשויה להוות חלופה.טכניקה זו מבוססת על שימוש בצבע ניאון הנקשר באופן ספציפי ל-dsDNA רק הקומפלקס הכולל חומצת גרעין וצבע מתרגש על ידי האור, ולאחר מכן הוא יפלוט אור באורך גל מעט גבוה יותר.כאן, עוצמת האות הפלורסנט פרופורציונלית לכמות ה-DNA, ולקביעת הריכוז הוא מוערך ביחס לעקומה סטנדרטית.היתרונות של שיטה זו נשענים על הספציפיות של הקשר, אשר שוללת את ההשפעות החיצוניות המוכנסות על ידי זיהום, כמו גם על היכולת הנובעת לזהות ריכוזים נמוכים מאוד של DNA.ההתאמה של כל אחת מהשיטות תלויה בעיקר בריכוז המדגם ובטוהר;במקרים רבים אף מומלץ ליישם את שתי השיטות במקביל.