Kuigi teoreetiliselt piisaks ühest matriitsi molekulist, kasutatakse klassikalise PCR jaoks tavaliselt tunduvalt suuremaid DNA koguseid, näiteks kuni 1 µg genoomset imetaja DNA-d ja kõigest 1 pg plasmiidset DNA-d.Optimaalne kogus sõltub suuresti sihtjärjestuse koopiate arvust ja ka selle keerukusest.
Kui matriitsi kasutatakse väga vähe, on piisava koguse saaduse saamiseks vaja amplifikatsioonitsüklite arvu vastavalt suurendada.Taq polümeraas, mida kasutatakse enamikus PCR katsetes, ei oma korrektsioonifunktsiooni (3'-5' eksonukleaasi aktiivsus);seega ei saa amplifitseerimisel tekkivaid vigu parandada.Mida suurem on tsüklite arv, seda levinum on vigase toote võimendamine.Teisest küljest, kui matriitsi kogus on liiga suur, suureneb tõenäosus, et praimerid anniilivad teiste (mitte sajaprotsendiliselt täiendavate) järjestustega, aga ka praimerite dimeeride moodustumine, mille tulemuseks on praimerite amplifitseerimine. kõrvalsaadused.Paljudel juhtudel eraldatakse DNA rakukultuuridest või mikroorganismidest ja kasutatakse seejärel PCR matriitsina.Pärast puhastamist on vaja määrata DNA kontsentratsioon, et oleks võimalik määratleda PCR seadistamiseks vajalik maht.Kuigi agaroosgeelelektroforees võib anda hinnangu, pole see meetod kaugeltki täpne.UV-Vis spektrofotomeetria on kehtestatud nukleiinhapete kvantifitseerimise kuldstandardiks;see otsene ja seetõttu lihtne ja kiire meetod mõõdab proovi neeldumist lainepikkusel 260 nm ja kontsentratsioon arvutatakse teisendusteguri abil.
Kui DNA kontsentratsioon on aga väga madal (< 1 µg/mL dsDNA) või kui see on saastunud ainetega, mis neelavad ka 260 nm vahemikus (nt RNA, valk, soolad), saavutab see meetod oma piirangud.Väga madalate kontsentratsioonide korral muutuvad näidud peagi liiga ebatäpseks, et neid kasutada, ja saaste põhjustab tegeliku väärtuse (mõnikord tohutu) ülehindamise.Sel juhul võib alternatiiviks olla kvantifitseerimine fluorestsentsi abil.See tehnika põhineb fluorestsentsvärvi kasutamisel, mis seondub spetsiifiliselt dsDNA-ga, ainult nukleiinhapet ja värvainet sisaldav kompleks ergastatakse valgusega ning seejärel kiirgab see veidi kõrgema lainepikkusega valgust.Siin on fluorestsentssignaali intensiivsus võrdeline DNA kogusega ja kontsentratsiooni määramiseks hinnatakse seda standardkõvera suhtes.Selle meetodi eelised põhinevad sideme spetsiifilisusel, mis välistab saastumisest tulenevad välismõjud, aga ka sellest tuleneval võimel tuvastada väga madalaid DNA kontsentratsioone.Kummagi meetodi sobivus sõltub peamiselt proovi kontsentratsioonist ja puhtusest;paljudel juhtudel võib olla isegi soovitatav rakendada mõlemat meetodit paralleelselt.
Postitusaeg: 30. november 2022