Хотя теоретически одной молекулы матрицы было бы достаточно, для классической ПЦР обычно используются значительно большие количества ДНК, например, до 1 мкг геномной ДНК млекопитающих и всего лишь 1 пг плазмидной ДНК.Оптимальное количество во многом зависит от количества копий целевой последовательности, а также от ее сложности.
Если используется очень мало шаблона, для получения достаточного количества продукта потребуется соответствующее увеличение количества циклов амплификации.Полимераза Taq, которая используется в большинстве экспериментов ПЦР, не обладает корректирующей функцией (3'-5' экзонуклеазная активность);таким образом, ошибки, возникающие во время амплификации, исправить невозможно.Чем выше количество циклов, тем более распространенным будет увеличение дефектного продукта.Если же количество матрицы слишком велико, то увеличится вероятность отжига праймеров с другими (не стопроцентно комплементарными) последовательностями, а также образования димеров праймеров, что приведет к амплификации побочные продукты.Во многих случаях ДНК выделяют из клеточных культур или микроорганизмов и впоследствии используют в качестве матрицы ПЦР.После очистки необходимо определить концентрацию ДНК, чтобы иметь возможность определить объем, необходимый для установки ПЦР.Хотя электрофорез в агарозном геле может служить для оценки, этот метод далек от точности.УФ-Вид-спектрофотометрия признана золотым стандартом количественного определения нуклеиновых кислот;Этот прямой и, следовательно, простой и быстрый метод измеряет поглощение образца при длине волны 260 нм, а концентрация рассчитывается с помощью коэффициента пересчета.
Однако если концентрация ДНК очень низкая (< 1 мкг/мл дцДНК) или если она загрязнена веществами, которые также поглощают в диапазоне 260 нм (например, РНК, белок, соли), этот метод достигнет своих ограничений.В случае очень низких концентраций показания вскоре станут слишком неточными, чтобы их можно было использовать, а загрязнения приведут к (иногда огромному) завышению фактического значения.В этом случае альтернативой может стать количественная оценка с использованием флуоресценции.Этот метод основан на использовании флуоресцентного красителя, который специфически связывается с дцДНК, только комплекс, включающий нуклеиновую кислоту и краситель, возбуждается светом и впоследствии излучает свет с немного более высокой длиной волны.Здесь интенсивность флуоресцентного сигнала пропорциональна количеству ДНК, и для определения концентрации ее оценивают по отношению к стандартной кривой.Преимущества этого метода заключаются в специфичности связи, исключающей внешние воздействия, вызванные загрязнением, а также в получаемой в результате способности обнаруживать очень низкие концентрации ДНК.Пригодность любого метода зависит главным образом от концентрации и чистоты образца;во многих случаях может быть даже целесообразно применять оба метода параллельно.
Время публикации: 30 ноября 2022 г.