Selv om ett molekyl av malen i teorien ville være tilstrekkelig, brukes vanligvis betydelig større mengder DNA for en klassisk PCR, for eksempel opptil 1 µg genomisk pattedyr-DNA og så lite som 1 pg plasmid-DNA.Den optimale mengden avhenger i stor grad av antall kopier av målsekvensen, så vel som av dens kompleksitet.
Hvis svært lite mal brukes, vil en tilsvarende økning i antall amplifikasjonssykluser være nødvendig for å oppnå en tilstrekkelig mengde produkt.En Taq-polymerase som brukes til de fleste PCR-eksperimenter har ikke en korreksjonsfunksjon (3′-5′ eksonukleaseaktivitet);dermed kan feil som oppstår under forsterkning ikke korrigeres.Jo høyere antall sykluser, jo mer utbredt vil amplifikasjonen av feil produkt være.Hvis på den annen side mengden av templat er for høy, vil sannsynligheten for at primere annealer til andre (ikke hundre prosent komplementære) sekvenser, samt dannelsen av primer-dimerer, øke, noe som vil resultere i amplifikasjon av biprodukter.I mange tilfeller blir DNA isolert fra cellekulturer eller fra mikroorganismer og deretter brukt som en PCR-mal.Etter rensing er det nødvendig å bestemme konsentrasjonen av DNA for å kunne definere volumet som kreves for PCR-oppsettet.Mens agarosegelelektroforese kan tjene til å gi et estimat, er denne metoden langt fra nøyaktig.UV-Vis spektrofotometri er etablert som gullstandarden for kvantifisering av nukleinsyrer;denne direkte og derfor enkle og raske metoden måler absorbansen til prøven ved 260 nm, og konsentrasjonen beregnes ved hjelp av en konverteringsfaktor.
Hvis DNA-konsentrasjonen derimot er svært lav (< 1 µg/mL dsDNA), eller hvis den er forurenset med stoffer som også absorberer i 260 nm-området (f.eks. RNA, protein, salter), vil denne metoden nå sine begrensninger.Ved svært lave konsentrasjoner vil avlesningene snart bli for unøyaktige til å være nyttige, og forurensninger vil føre til (noen ganger enorm) overestimering av den faktiske verdien.I dette tilfellet kan kvantifisering ved bruk av fluorescens være et alternativ.Denne teknikken er basert på bruk av et fluorescerende fargestoff som binder spesifikt til dsDNA, bare komplekset som består av nukleinsyre og fargestoff blir eksitert av lyset, og det vil deretter sende ut lys med en litt høyere bølgelengde.Her er intensiteten til det fluorescerende signalet proporsjonal med mengden DNA, og for å bestemme konsentrasjonen vurderes den i forhold til en standardkurve.Fordelene med denne metoden hviler på bindingens spesifisitet, som utelukker ytre påvirkninger introdusert av forurensning, samt på den resulterende evnen til å oppdage svært lave konsentrasjoner av DNA.Egnetheten til begge metodene avhenger hovedsakelig av prøvekonsentrasjon og renhet;i mange tilfeller kan det til og med være tilrådelig å bruke begge metodene parallelt.
Innleggstid: 30. november 2022