Chociaż teoretycznie wystarczyłaby jedna cząsteczka matrycy, w klasycznej reakcji PCR zwykle stosuje się znacznie większe ilości DNA, na przykład do 1 µg genomowego DNA ssaków i zaledwie 1 µg plazmidowego DNA.Optymalna ilość zależy w dużej mierze od liczby kopii sekwencji docelowej, a także od jej złożoności.
Jeżeli stosuje się bardzo małą matrycę, konieczne będzie odpowiednie zwiększenie liczby cykli amplifikacji, aby uzyskać wystarczającą ilość produktu.Polimeraza Taq stosowana w większości eksperymentów PCR nie posiada funkcji korekcyjnej (aktywność egzonukleazy 3′-5′);w związku z tym błędów występujących podczas wzmacniania nie można skorygować.Im większa liczba cykli, tym częstsza będzie amplifikacja wadliwego produktu.Jeśli natomiast ilość matrycy będzie zbyt duża, wzrośnie prawdopodobieństwo przyłączania się starterów do innych (nie w stu procentach komplementarnych) sekwencji, a także tworzenia dimerów starterów, co będzie skutkować amplifikacją przez produkty.W wielu przypadkach DNA izoluje się z hodowli komórkowych lub mikroorganizmów, a następnie wykorzystuje jako matrycę do PCR.Po oczyszczeniu konieczne jest określenie stężenia DNA, aby móc określić objętość wymaganą do konfiguracji PCR.Chociaż elektroforeza w żelu agarozowym może służyć do oszacowania, metoda ta jest daleka od dokładnej.Spektrofotometria UV-Vis została uznana za złoty standard w oznaczaniu ilościowym kwasów nukleinowych;ta bezpośrednia, a przez to łatwa i szybka metoda mierzy absorbancję próbki przy 260 nm, a stężenie oblicza się za pomocą przelicznika.
Jeśli jednak stężenie DNA jest bardzo niskie (< 1 µg/ml dsDNA) lub jest zanieczyszczone substancjami, które również absorbują w zakresie 260 nm (np. RNA, białko, sole), metoda ta osiągnie swoje ograniczenia.W przypadku bardzo niskich stężeń odczyty wkrótce staną się zbyt niedokładne, aby mogły być przydatne, a zanieczyszczenia doprowadzą do (czasami ogromnego) zawyżenia rzeczywistej wartości.W tym przypadku alternatywą może być oznaczenie ilościowe za pomocą fluorescencji.Technika ta opiera się na zastosowaniu barwnika fluorescencyjnego, który wiąże się specyficznie z dsDNA, jedynie kompleks zawierający kwas nukleinowy i barwnik jest wzbudzany przez światło, a następnie emituje światło o nieco większej długości fali.Tutaj intensywność sygnału fluorescencyjnego jest proporcjonalna do ilości DNA, a dla określenia stężenia oceniana jest w odniesieniu do krzywej standardowej.Zalety tej metody polegają na specyficzności wiązania, która wyklucza wpływy zewnętrzne spowodowane zanieczyszczeniem, a także na wynikającej z tego możliwości wykrywania bardzo niskich stężeń DNA.Przydatność którejkolwiek metody zależy głównie od stężenia i czystości próbki;w wielu przypadkach może być nawet wskazane równoległe stosowanie obu metod.
Czas publikacji: 30 listopada 2022 r