Anche se in teoria una molecola del modello sarebbe sufficiente, per una PCR classica vengono solitamente utilizzate quantità considerevolmente maggiori di DNA, ad esempio fino a 1 µg di DNA genomico di mammifero e solo 1 pg di DNA plasmidico.La quantità ottimale dipende in gran parte dal numero di copie della sequenza target, nonché dalla sua complessità.
Se viene utilizzata una quantità minima di templato, sarà necessario un corrispondente aumento del numero di cicli di amplificazione per ottenere una quantità sufficiente di prodotto.Una Taq polimerasi utilizzata per la maggior parte degli esperimenti di PCR non presenta una funzione di correzione (attività di esonucleasi 3′-5′);pertanto, gli errori che si verificano durante l'amplificazione non possono essere corretti.Maggiore è il numero di cicli, maggiore sarà l'amplificazione del prodotto difettoso.Se, d'altra parte, la quantità di templato è troppo elevata, aumenterà la probabilità che i primer si ricoppino in altre sequenze (non complementari al cento per cento), così come la formazione di dimeri di primer, il che si tradurrà nell'amplificazione di sottoprodotti.In molti casi, il DNA viene isolato da colture cellulari o da microrganismi e successivamente utilizzato come modello PCR.Dopo la purificazione, è necessario determinare la concentrazione del DNA per poter definire il volume necessario per l'allestimento della PCR.Sebbene l'elettroforesi su gel di agarosio possa servire a fornire una stima, questo metodo è lungi dall'essere accurato.La spettrofotometria UV-Vis è stata stabilita come il gold standard per la quantificazione degli acidi nucleici;questo metodo diretto e quindi facile e veloce misura l'assorbanza del campione a 260 nm e la concentrazione viene calcolata con l'aiuto di un fattore di conversione.
Se tuttavia la concentrazione del DNA è molto bassa (< 1 µg/mL dsDNA) o se è contaminato da sostanze che assorbono anche nell'intervallo di 260 nm (ad es. RNA, proteine, sali), questo metodo raggiungerà i suoi limiti.In caso di concentrazioni molto basse, le letture diventeranno presto troppo imprecise per essere utili e le contaminazioni porteranno a una sovrastima (a volte enorme) del valore reale.In questo caso, la quantificazione mediante fluorescenza può rappresentare un'alternativa.Questa tecnica si basa sull'uso di un colorante fluorescente che si lega specificamente al dsDNA: solo il complesso formato da acido nucleico e colorante viene eccitato dalla luce e successivamente emetterà luce con una lunghezza d'onda leggermente superiore.Qui l'intensità del segnale fluorescente è proporzionale alla quantità di DNA e per determinare la concentrazione viene valutata rispetto ad una curva standard.I vantaggi di questo metodo risiedono nella specificità del legame, che esclude le influenze esterne introdotte dalla contaminazione, nonché nella conseguente capacità di rilevare concentrazioni molto basse di DNA.L'idoneità di entrambi i metodi dipende principalmente dalla concentrazione e dalla purezza del campione;in molti casi può addirittura essere consigliabile applicare entrambi i metodi in parallelo.
Orario di pubblicazione: 30 novembre 2022