Iako bi u teoriji jedan molekul šablona bio dovoljan, za klasični PCR se obično koriste znatno veće količine DNK, na primjer, do 1 µg genomske DNK sisara i samo 1 pg plazmidne DNK.Optimalna količina u velikoj mjeri zavisi od broja kopija ciljne sekvence, kao i od njene složenosti.
Ako se koristi vrlo malo šablona, biće potrebno odgovarajuće povećanje broja ciklusa amplifikacije da bi se dobila dovoljna količina proizvoda.Taq polimeraza koja se koristi za većinu PCR eksperimenata nema funkciju korekcije (aktivnost 3′-5′ egzonukleaze);stoga se greške koje se javljaju tokom pojačanja ne mogu ispraviti.Što je veći broj ciklusa, to će preovlađivati pojačanje proizvoda s nedostatkom.Ako je, s druge strane, količina šablona previsoka, povećava se vjerovatnoća spajanja prajmera na druge (ne stopostotno komplementarne) sekvence, kao i formiranje dimera prajmera, što će rezultirati amplifikacijom prajmera. nusproizvodi.U mnogim slučajevima, DNK se izoluje iz ćelijskih kultura ili iz mikroorganizama i zatim se koristi kao PCR šablon.Nakon pročišćavanja, potrebno je odrediti koncentraciju DNK kako bi se mogao definirati volumen koji je potreban za PCR postavku.Dok elektroforeza u agaroznom gelu može poslužiti za pružanje procjene, ova metoda je daleko od tačne.UV-Vis spektrofotometrija je ustanovljena kao zlatni standard za kvantifikaciju nukleinskih kiselina;ova direktna i stoga laka i brza metoda mjeri apsorpciju uzorka na 260 nm, a koncentracija se izračunava uz pomoć faktora konverzije.
Međutim, ako je koncentracija DNK vrlo niska (< 1 µg/mL dsDNA), ili ako je kontaminirana supstancama koje također apsorbiraju u rasponu od 260 nm (npr. RNK, proteini, soli), ova metoda će dostići svoja ograničenja.U slučaju vrlo niskih koncentracija, očitavanja će uskoro postati previše neprecizna da bi bila od koristi, a kontaminacije će dovesti do (ponekad enormnog) precjenjivanja stvarne vrijednosti.U ovom slučaju, kvantifikacija pomoću fluorescencije može predstavljati alternativu.Ova tehnika se zasniva na upotrebi fluorescentne boje koja se specifično vezuje za dsDNK, samo kompleks koji sadrži nukleinsku kiselinu i boju pobuđuje svetlost, a zatim će emitovati svetlost nešto veće talasne dužine.Ovdje je intenzitet fluorescentnog signala proporcionalan količini DNK, a za određivanje koncentracije se procjenjuje u odnosu na standardnu krivu.Prednosti ove metode počivaju na specifičnosti veze, koja isključuje vanjske utjecaje unesene kontaminacijom, kao i na rezultirajuću sposobnost detekcije vrlo niskih koncentracija DNK.Pogodnost bilo koje metode uglavnom ovisi o koncentraciji uzorka i čistoći;u mnogim slučajevima može čak biti preporučljivo primijeniti obje metode paralelno.
Vrijeme objave: 30.11.2022