Въпреки че на теория една молекула от шаблона би била достатъчна, значително по-големи количества ДНК обикновено се използват за класически PCR, например до 1 µg геномна ДНК на бозайник и само 1 pg плазмидна ДНК.Оптималното количество зависи до голяма степен от броя на копията на целевата последователност, както и от нейната сложност.
Ако се използва много малко шаблон, ще е необходимо съответно увеличение на броя на циклите на усилване, за да се получи достатъчно количество продукт.Taq полимераза, която се използва за повечето PCR експерименти, не разполага с коригираща функция (3'-5' екзонуклеазна активност);по този начин грешките, възникващи по време на усилване, не могат да бъдат коригирани.Колкото по-голям е броят на циклите, толкова по-разпространено ще бъде усилването на дефектен продукт.Ако, от друга страна, количеството на матрицата е твърде голямо, вероятността праймерите да се свържат с други (не сто процента комплиментарни) последователности, както и образуването на праймерни димери, ще се увеличи, което ще доведе до усилване на странични продукти.В много случаи ДНК се изолира от клетъчни култури или от микроорганизми и впоследствие се използва като PCR шаблон.След пречистването е необходимо да се определи концентрацията на ДНК, за да може да се определи обемът, необходим за настройката на PCR.Въпреки че електрофорезата в агарозен гел може да служи за оценка, този метод далеч не е точен.UV-Vis спектрофотометрията е установена като златен стандарт за количествено определяне на нуклеинови киселини;този директен и следователно лесен и бърз метод измерва абсорбцията на пробата при 260 nm, а концентрацията се изчислява с помощта на коефициент на преобразуване.
Ако обаче концентрацията на ДНК е много ниска (< 1 µg/mL dsDNA) или ако е замърсена с вещества, които също абсорбират в диапазона от 260 nm (напр. РНК, протеин, соли), този метод ще достигне своите ограничения.В случай на много ниски концентрации, показанията скоро ще станат твърде неточни, за да бъдат полезни, а замърсяванията ще доведат до (понякога огромно) надценяване на действителната стойност.В този случай количественото определяне с помощта на флуоресценция може да представлява алтернатива.Тази техника се основава на използването на флуоресцентно багрило, което се свързва специфично с dsDNA, само комплексът, съдържащ нуклеинова киселина и багрило, се възбужда от светлината и впоследствие ще излъчва светлина с малко по-висока дължина на вълната.Тук интензитетът на флуоресцентния сигнал е пропорционален на количеството ДНК и за определяне на концентрацията се оценява по отношение на стандартна крива.Предимствата на този метод се основават на специфичността на връзката, която изключва външните влияния, въведени от замърсяване, както и на получената способност за откриване на много ниски концентрации на ДНК.Пригодността на двата метода зависи главно от концентрацията и чистотата на пробата;в много случаи може дори да е препоръчително да се прилагат и двата метода паралелно.
Време на публикуване: 30 ноември 2022 г