Aj keď by teoreticky stačila jedna molekula templátu, na klasickú PCR sa typicky používajú podstatne väčšie množstvá DNA, napríklad až 1 ug genómovej cicavčej DNA a len 1 pg plazmidovej DNA.Optimálne množstvo závisí vo veľkej miere od počtu kópií cieľovej sekvencie, ako aj od jej zložitosti.
Ak sa použije veľmi málo templátu, na získanie dostatočného množstva produktu bude potrebné zodpovedajúce zvýšenie počtu amplifikačných cyklov.Taq polymeráza, ktorá sa používa pre väčšinu PCR experimentov, nemá korekčnú funkciu (3'-5' exonukleázová aktivita);preto chyby vyskytujúce sa počas amplifikácie nemožno opraviť.Čím vyšší je počet cyklov, tým prevládajúca bude amplifikácia chybného produktu.Ak je na druhej strane množstvo templátu príliš vysoké, zvýši sa pravdepodobnosť, že priméry anelujú na iné (nie stopercentne komplementárne) sekvencie, ako aj tvorba dimérov primérov, čo bude mať za následok amplifikáciu vedľajších produktov.V mnohých prípadoch je DNA izolovaná z bunkových kultúr alebo z mikroorganizmov a následne použitá ako PCR templát.Po purifikácii je potrebné určiť koncentráciu DNA, aby bolo možné definovať objem, ktorý je potrebný pre nastavenie PCR.Zatiaľ čo elektroforéza na agarózovom géli môže slúžiť ako odhad, táto metóda nie je ani zďaleka presná.UV-Vis spektrofotometria bola zavedená ako zlatý štandard na kvantifikáciu nukleových kyselín;táto priama a preto jednoduchá a rýchla metóda meria absorbanciu vzorky pri 260 nm a koncentrácia sa vypočíta pomocou konverzného faktora.
Ak je však koncentrácia DNA veľmi nízka (< 1 µg/ml dsDNA), alebo ak je kontaminovaná látkami, ktoré tiež absorbujú v rozsahu 260 nm (napr. RNA, proteín, soli), táto metóda dosiahne svoje obmedzenia.V prípade veľmi nízkych koncentrácií sa namerané hodnoty čoskoro stanú príliš nepresnými na to, aby sa dali použiť, a kontaminácie povedú k (niekedy obrovskému) nadhodnoteniu skutočnej hodnoty.V tomto prípade môže byť alternatívou kvantifikácia pomocou fluorescencie.Táto technika je založená na použití fluorescenčného farbiva, ktoré sa špecificky viaže na dsDNA, iba komplex obsahujúci nukleovú kyselinu a farbivo je excitovaný svetlom a následne bude emitovať svetlo s mierne vyššou vlnovou dĺžkou.Intenzita fluorescenčného signálu je tu úmerná množstvu DNA a na stanovenie koncentrácie sa vyhodnocuje vo vzťahu k štandardnej krivke.Výhody tejto metódy spočívajú v špecifickosti väzby, ktorá vylučuje vonkajšie vplyvy spôsobené kontamináciou, ako aj vo výslednej schopnosti detekovať veľmi nízke koncentrácie DNA.Vhodnosť oboch metód závisí hlavne od koncentrácie a čistoty vzorky;v mnohých prípadoch môže byť dokonca vhodné použiť obe metódy paralelne.
Čas odoslania: 30. novembra 2022