Bisan pa sa teoriya, ang usa ka molekula sa template igo na, ang mas dako nga kantidad sa DNA kasagarang gigamit alang sa usa ka classic PCR, pananglitan, hangtod sa 1 µg sa genomic mammalian DNA ug ingon ka gamay sa 1 pg sa plasmid DNA.Ang labing maayo nga kantidad nagdepende sa kadaghanan sa gidaghanon sa mga kopya sa target nga han-ay, ingon man sa pagkakomplikado niini.
Kung gamay ra kaayo nga template ang gigamit, usa ka katugbang nga pagtaas sa gidaghanon sa mga siklo sa amplification ang kinahanglan aron makakuha usa ka igo nga kantidad sa produkto.Ang Taq polymerase nga gigamit sa kadaghanan sa mga eksperimento sa PCR walay function sa pagtul-id (3′-5′ exonuclease nga kalihokan);sa ingon, ang mga sayup nga nahitabo sa panahon sa pagpadako dili matul-id.Kon mas taas ang gidaghanon sa mga siklo, mas kaylap ang pagpadako sa sayup nga produkto.Kung, sa laing bahin, ang kantidad sa template labi ka taas, ang posibilidad nga ang mga primer mag-anil sa lain (dili usa ka gatos nga porsyento nga komplimentaryo) nga mga han-ay, ingon man ang pagporma sa mga primer dimer, motaas, nga moresulta sa pagpadako sa mga produkto.Sa daghang mga kaso, ang DNA nahimulag gikan sa mga kultura sa cell o gikan sa mga microorganism ug pagkahuman gigamit ingon usa ka template sa PCR.Pagkahuman sa pagputli, kinahanglan nga mahibal-an ang konsentrasyon sa DNA aron mahibal-an ang gidaghanon nga gikinahanglan alang sa pag-setup sa PCR.Samtang ang agarose gel electrophoresis mahimong maghatag ug banabana, kini nga pamaagi layo sa tukma.Ang UV-Vis spectrophotometry naestablisar isip gold standard para sa quantification sa nucleic acid;kini nga direkta ug busa dali ug dali nga pamaagi nagsukod sa pagsuyup sa sample sa 260 nm, ug ang konsentrasyon gikalkulo sa tabang sa usa ka hinungdan sa pagkakabig.
Kung ang konsentrasyon sa DNA ubos kaayo, bisan pa (< 1 µg/mL dsDNA), o kon kontaminado kini sa mga substansiya nga mosuhop usab sa 260 nm range (eg RNA, protina, asin), kini nga pamaagi makaabot sa mga limitasyon niini.Sa kaso sa ubos kaayo nga konsentrasyon, ang mga pagbasa sa dili madugay mahimong dili tukma aron magamit, ug ang mga kontaminasyon mosangpot sa (usahay dako kaayo) nga sobra nga pagtantiya sa aktuwal nga bili.Sa kini nga kaso, ang pag-ihap gamit ang fluorescence mahimong magpakita usa ka alternatibo.Kini nga teknik gibase sa paggamit sa usa ka fluorescent dye nga espesipikong nagbugkos sa dsDNA lamang ang complex nga naglangkob sa nucleic acid ug tina ang gihinam-hinam sa kahayag, ug kini sa ulahi mopagawas sa kahayag sa usa ka gamay nga mas taas nga wavelength.Dinhi, ang intensity sa fluorescent signal mao ang proporsyonal sa gidaghanon sa DNA, ug alang sa pagtino sa konsentrasyon kini gibana-bana nga may kalabutan sa usa ka standard curve.Ang mga bentaha sa kini nga pamaagi nagsalig sa espesipiko sa bugkos, nga wala maglakip sa mga impluwensya sa gawas nga gipaila sa kontaminasyon, ingon man usab sa sangputanan nga abilidad sa pag-ila sa ubos kaayo nga konsentrasyon sa DNA.Ang kaangayan sa bisan hain nga paagi nag-agad nag-una sa sample konsentrasyon ug kaputli;sa daghang mga kaso mahimo’g maayo nga gamiton ang duha nga mga pamaagi nga managsama.
Oras sa pag-post: Nob-30-2022