கோட்பாட்டில், டெம்ப்ளேட்டின் ஒரு மூலக்கூறு போதுமானதாக இருந்தாலும், ஒரு உன்னதமான PCR க்கு கணிசமான அளவு டிஎன்ஏ பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, உதாரணமாக, 1 µg வரை மரபணு பாலூட்டிகளின் DNA மற்றும் 1 pg பிளாஸ்மிட் DNA.உகந்த தொகையானது இலக்கு வரிசையின் நகல்களின் எண்ணிக்கை மற்றும் அதன் சிக்கலான தன்மையைப் பொறுத்தது.
மிகக் குறைந்த டெம்ப்ளேட்டைப் பயன்படுத்தினால், போதுமான அளவு உற்பத்தியைப் பெற, பெருக்க சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையில் அதிகரிப்பு தேவைப்படும்.பெரும்பாலான PCR சோதனைகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படும் Taq பாலிமரேஸ் ஒரு திருத்தச் செயல்பாட்டைக் கொண்டிருக்கவில்லை (3′-5′ exonuclease செயல்பாடு);இதனால், பெருக்கத்தின் போது ஏற்படும் பிழைகளை சரி செய்ய முடியாது.அதிக எண்ணிக்கையிலான சுழற்சிகள், குறைபாடுள்ள தயாரிப்புகளின் பெருக்கம் அதிகமாக இருக்கும்.மறுபுறம், வார்ப்புருவின் அளவு மிக அதிகமாக இருந்தால், பிற (நூறு சதவீதம் பாராட்டுக்குரியது அல்ல) வரிசைகளுக்கு ப்ரைமர்கள் அனீலிங் செய்வதற்கான நிகழ்தகவு, அத்துடன் ப்ரைமர் டைமர்களின் உருவாக்கம் ஆகியவை அதிகரிக்கும், இது பெருக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும். துணை தயாரிப்புகள்.பல சந்தர்ப்பங்களில், டிஎன்ஏ செல் கலாச்சாரங்களிலிருந்து அல்லது நுண்ணுயிரிகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டு பின்னர் PCR டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.சுத்திகரிப்புக்குப் பிறகு, PCR அமைப்பிற்குத் தேவையான அளவை வரையறுக்க DNAவின் செறிவைத் தீர்மானிக்க வேண்டியது அவசியம்.அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் ஒரு மதிப்பீட்டை வழங்க உதவுகிறது, இந்த முறை துல்லியமாக இல்லை.UV-Vis ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமெட்ரியானது நியூக்ளிக் அமிலங்களின் அளவீட்டுக்கான தங்கத் தரமாக நிறுவப்பட்டுள்ளது;இந்த நேரடியான மற்றும் எளிதான மற்றும் விரைவான முறையானது மாதிரியின் உறிஞ்சுதலை 260 nm இல் அளவிடுகிறது, மேலும் செறிவு மாற்றும் காரணியின் உதவியுடன் கணக்கிடப்படுகிறது.
டிஎன்ஏ செறிவு மிகவும் குறைவாக இருந்தாலும் (<1 µg/mL dsDNA), அல்லது 260 nm வரம்பில் உறிஞ்சும் பொருட்களால் மாசுபட்டிருந்தால் (எ.கா. RNA, புரதம், உப்புகள்), இந்த முறை அதன் வரம்புகளை அடையும்.மிகக் குறைந்த செறிவுகளில், வாசிப்புகள் விரைவில் பயன்படுத்த முடியாத அளவுக்குத் துல்லியமாகிவிடும், மேலும் மாசுபாடுகள் உண்மையான மதிப்பை (சில நேரங்களில் மகத்தானதாக) மிகைப்படுத்தி மதிப்பிட வழிவகுக்கும்.இந்த வழக்கில், ஃப்ளோரசன்ஸைப் பயன்படுத்தி அளவீடு ஒரு மாற்றீட்டை வழங்கலாம்.இந்த நுட்பம் ஒரு ஃப்ளோரசன்ட் சாயத்தைப் பயன்படுத்துவதை அடிப்படையாகக் கொண்டது, இது நியூக்ளிக் அமிலம் மற்றும் சாயத்தை உள்ளடக்கிய சிக்கலானது மட்டுமே டிஎஸ்டிஎன்ஏவுடன் பிணைக்கப்பட்டுள்ளது, மேலும் இது சிறிது அதிக அலைநீளத்தின் ஒளியை வெளியிடும்.இங்கே, ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலின் தீவிரம் டிஎன்ஏவின் அளவிற்கு விகிதாசாரமாகும், மேலும் செறிவைத் தீர்மானிப்பதற்கு இது ஒரு நிலையான வளைவுடன் தொடர்புடையதாக மதிப்பிடப்படுகிறது.இந்த முறையின் நன்மைகள் பிணைப்பின் பிரத்தியேகத்தன்மையின் மீது தங்கியுள்ளது, இது மாசுபாட்டால் அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட வெளிப்புற தாக்கங்களை விலக்குகிறது, அத்துடன் DNAவின் மிகக் குறைந்த செறிவுகளைக் கண்டறியும் திறனையும் கொண்டுள்ளது.இரண்டு முறைகளின் பொருத்தமும் முக்கியமாக மாதிரி செறிவு மற்றும் தூய்மையைப் பொறுத்தது;பல சந்தர்ப்பங்களில், இரண்டு முறைகளையும் இணையாகப் பயன்படுத்துவது நல்லது.
இடுகை நேரம்: நவம்பர்-30-2022