Иако би у теорији један молекул шаблона био довољан, за класични ПЦР се обично користе знатно веће количине ДНК, на пример, до 1 µг геномске ДНК сисара и само 1 пг плазмидне ДНК.Оптимална количина у великој мери зависи од броја копија циљне секвенце, као и од њене сложености.
Ако се користи врло мало шаблона, биће потребно одговарајуће повећање броја циклуса амплификације да би се добила довољна количина производа.Так полимераза која се користи за већину ПЦР експеримената нема функцију корекције (активност 3′-5′ егзонуклеазе);стога се грешке које се јављају током појачања не могу исправити.Што је већи број циклуса, то ће преовлађивати појачање производа са недостатком.Ако је, с друге стране, количина шаблона превисока, повећава се вероватноћа да се прајмери закаре на друге (не сто посто комплементарне) секвенце, као и формирање димера прајмера, што ће резултирати појачавањем нуспроизводи.У многим случајевима, ДНК се изолује из ћелијских култура или из микроорганизама и затим се користи као ПЦР шаблон.Након пречишћавања, потребно је одредити концентрацију ДНК да би се могла дефинисати запремина која је потребна за ПЦР подешавање.Док електрофореза у агарозном гелу може послужити за процену, ова метода је далеко од тачне.УВ-Вис спектрофотометрија је установљена као златни стандард за квантификацију нуклеинских киселина;ова директна и стога лака и брза метода мери апсорпцију узорка на 260 нм, а концентрација се израчунава уз помоћ фактора конверзије.
Међутим, ако је концентрација ДНК веома ниска (< 1 µг/мЛ дсДНК) или ако је контаминирана супстанцама које такође апсорбују у опсегу од 260 нм (нпр. РНК, протеини, соли), овај метод ће достићи своја ограничења.У случају веома ниских концентрација, очитавања ће ускоро постати превише нетачна да би била од користи, а контаминације ће довести до (понекад огромног) прецењивања стварне вредности.У овом случају, квантификација коришћењем флуоресценције може представљати алтернативу.Ова техника се заснива на коришћењу флуоресцентне боје која се специфично везује за дсДНК само је комплекс који садржи нуклеинску киселину и боју побуђен светлошћу, а затим ће емитовати светлост нешто веће таласне дужине.Овде је интензитет флуоресцентног сигнала пропорционалан количини ДНК, а за одређивање концентрације се процењује у односу на стандардну криву.Предности ове методе почивају на специфичности везе, која искључује спољне утицаје унесене контаминацијом, као и на резултујућој способности детекције веома ниских концентрација ДНК.Погодност било које методе зависи углавном од концентрације и чистоће узорка;у многим случајевима може чак бити препоручљиво да се обе методе примењују паралелно.
Време поста: 30.11.2022