Nəzəri cəhətdən şablonun bir molekulu kifayət etsə də, klassik PCR üçün adətən daha böyük miqdarda DNT istifadə olunur, məsələn, 1 µg-a qədər genomik məməli DNT və 1 pg qədər az plazmid DNT.Optimal məbləğ əsasən hədəf ardıcıllığının nüsxələrinin sayından, eləcə də mürəkkəbliyindən asılıdır.
Çox az şablon istifadə edilərsə, kifayət qədər miqdarda məhsul əldə etmək üçün gücləndirmə dövrlərinin sayında müvafiq artım tələb olunacaq.Əksər PCR təcrübələri üçün istifadə edilən Taq polimeraza korreksiya funksiyasına malik deyil (3′-5′ eksonükleaz aktivliyi);beləliklə, gücləndirmə zamanı baş verən xətalar düzəldilə bilməz.Dövrlərin sayı nə qədər çox olarsa, qüsurlu məhsulun gücləndirilməsi bir o qədər çox olacaqdır.Digər tərəfdən, şablonun miqdarı çox yüksək olarsa, primerlərin digər (yüz faiz tamamlayıcı deyil) ardıcıllıqla bağlanma ehtimalı, eləcə də primer dimerlərinin əmələ gəlməsi ehtimalı artacaq ki, bu da onların gücləndirilməsi ilə nəticələnəcəkdir. yan məhsullar.Bir çox hallarda DNT hüceyrə mədəniyyətlərindən və ya mikroorqanizmlərdən təcrid olunur və sonradan PCR şablonu kimi istifadə olunur.Təmizləmədən sonra, PCR qurulması üçün tələb olunan həcmi təyin etmək üçün DNT-nin konsentrasiyasını təyin etmək lazımdır.Agaroz gel elektroforezi təxmin etməyə xidmət edə bilsə də, bu üsul dəqiqlikdən uzaqdır.UV-Vis spektrofotometriyası nuklein turşularının miqdarının təyini üçün qızıl standart kimi müəyyən edilmişdir;bu birbaşa və buna görə də asan və sürətli üsul nümunənin 260 nm-də udulmasını ölçür və konsentrasiya çevrilmə əmsalının köməyi ilə hesablanır.
Bununla belə, DNT konsentrasiyası çox aşağı olarsa (< 1 µg/mL dsDNA) və ya 260 nm diapazonunda da udulan maddələrlə (məsələn, RNT, zülal, duzlar) çirklənirsə, bu üsul öz məhdudiyyətlərinə çatacaq.Çox aşağı konsentrasiyalar halında, oxunuşlar tezliklə istifadə oluna bilməyəcək qədər qeyri-dəqiq olacaq və çirklənmələr faktiki dəyərin (bəzən çox böyük) qiymətləndirilməsinə gətirib çıxaracaq.Bu halda, flüoresandan istifadə edərək kəmiyyətin təyini alternativ ola bilər.Bu texnika xüsusi olaraq dsDNA-ya bağlanan flüoresan boyanın istifadəsinə əsaslanır və yalnız nuklein turşusundan ibarət kompleks və boya işıqdan həyəcanlanır və o, sonradan bir qədər yüksək dalğa uzunluğunda işıq saçır.Burada flüoresan siqnalın intensivliyi DNT-nin miqdarına mütənasibdir və konsentrasiyanı təyin etmək üçün standart əyri ilə bağlı qiymətləndirilir.Bu metodun üstünlükləri çirklənmə ilə daxil olan xarici təsirləri istisna edən əlaqənin spesifikliyinə, həmçinin DNT-nin çox aşağı konsentrasiyalarını aşkar etmək qabiliyyətinə əsaslanır.Hər iki metodun uyğunluğu əsasən nümunənin konsentrasiyası və təmizliyindən asılıdır;bir çox hallarda hətta hər iki üsulu paralel tətbiq etmək məqsədəuyğun ola bilər.
Göndərmə vaxtı: 30 noyabr 2022-ci il