Eadhon ged a bhiodh e ann an teòiridh, gum biodh aon mholacile den teamplaid gu leòr, mar as trice bidh meudan gu math nas motha de DNA air an cleachdadh airson PCR clasaigeach, mar eisimpleir, suas ri 1 µg de DNA mamalan genomic agus cho beag ri 1 cg de DNA plasmid.Tha an ìre as fheàrr an urra gu ìre mhòr air an àireamh de lethbhric den t-sreath targaid, a bharrachd air cho iom-fhillte ‘s a tha e.
Mura tèid ach glè bheag de theamplaid a chleachdadh, bidh feum air àrdachadh co-ionann anns an àireamh de chearcaill leudachaidh gus meud gu leòr de thoraidhean fhaighinn.Chan eil gnìomh ceartachaidh aig Taq polymerase a thathas a’ cleachdadh airson a’ mhòr-chuid de dheuchainnean PCR (gnìomhan exonuclease 3 ′-5 ′);mar sin, chan urrainnear mearachdan a tha a’ tachairt aig àm leudachaidh a cheartachadh.Mar as àirde an àireamh de chuairtean, is ann as cumanta a bhios leudachadh air toradh lochtach.Ma tha, air an làimh eile, gu bheil an àireamh de theamplaidean ro àrd, meudaichidh an coltachd gum bi primers a’ ceangal ri sreathan eile (chan e ceud sa cheud moladh), a bharrachd air cruthachadh primer dimers, a thig gu leudachadh. fo-bhathar.Ann an iomadh cùis, tha DNA air a sgaradh bho chultaran cealla no bho meanbh-fhàs-bheairtean agus an uairsin air a chleachdadh mar theamplaid PCR.Às deidh glanadh, feumar faighinn a-mach dè an ìre den DNA a th ’ann gus a bhith comasach air an tomhas-lìonaidh a tha riatanach airson suidheachadh PCR a mhìneachadh.Ged a dh’ fhaodadh electrophoresis gel agarose tuairmse a thoirt seachad, tha an dòigh seo fada bho bhith ceart.Tha speactrophotometry UV-Vis air a stèidheachadh mar an inbhe òir airson a bhith a’ tomhas aigéid niuclasach;tha an dòigh dhìreach seo agus mar sin furasta agus luath a’ tomhas gabhail ris an sampall aig 260 nm, agus tha dùmhlachd air a thomhas le cuideachadh bho fhactar tionndaidh.
Ma tha an dùmhlachd DNA gu math ìosal, ge-tà (<1 µg/mL dsDNA), no ma tha e air a thruailleadh le stuthan a tha cuideachd a’ gabhail a-steach an raon 260 nm (me RNA, pròtain, salainn), ruigidh an dòigh seo na crìochan aige.Ann an cùis dùmhlachdan glè ìosal, bidh na leughaidhean a dh’ aithghearr ro mhearachdach airson a bhith air an cleachdadh, agus bidh truailleadh a’ leantainn gu cus tuairmse (uaireannan uamhasach) den fhìor luach.Anns a 'chùis seo, faodaidh tomhas a' cleachdadh fluorescence roghainn eile a thoirt seachad.Tha an dòigh seo stèidhichte air cleachdadh dath flùraiseach a tha a’ ceangal gu sònraichte ri dsDNA a-mhàin an toinnte a tha a’ toirt a-steach searbhag niuclasach agus dath a tha air bhioran leis an t-solas, agus às deidh sin cuiridh e a-mach solas le tonn-tonn beagan nas àirde.An seo, tha dian a’ chomharra flùraiseach co-rèireach ris an ìre de DNA, agus airson a bhith a’ dearbhadh an dùmhlachd tha e air a mheasadh a thaobh lùb àbhaisteach.Tha buannachdan an dòigh seo an urra ri sònraichteachd a’ cheangail, a tha a’ dùnadh a-mach na buaidhean bhon taobh a-muigh a thug truailleadh a-steach, a bharrachd air a’ chomas a thig às a bhith a’ lorg dùmhlachd glè ìosal de DNA.Tha freagarrachd an dà dhòigh gu mòr an urra ri dùmhlachd sampall agus purrachd;ann an iomadh cùis is dòcha gum biodh e ciallach an dà dhòigh a chleachdadh aig an aon àm.
Ùine puist: Samhain-30-2022