Vaikka teoriassa yksi templaatin molekyyli riittäisi, klassiseen PCR:ään käytetään tyypillisesti huomattavasti suurempia määriä DNA:ta, esimerkiksi jopa 1 ug genomista nisäkäs-DNA:ta ja vain 1 pg plasmidi-DNA:ta.Optimaalinen määrä riippuu suurelta osin kohdesekvenssin kopioiden määrästä sekä sen monimutkaisuudesta.
Jos templaattia käytetään hyvin vähän, tarvitaan vastaava lisäys amplifikaatiosyklien määrään riittävän tuotteen määrän saamiseksi.Taq-polymeraasi, jota käytetään useimmissa PCR-kokeissa, ei sisällä korjaustoimintoa (3'-5'-eksonukleaasiaktiivisuus);näin ollen vahvistuksen aikana ilmeneviä virheitä ei voida korjata.Mitä suurempi jaksojen määrä on, sitä yleisempää on viallisen tuotteen vahvistus.Jos toisaalta templaatin määrä on liian suuri, todennäköisyys, että alukkeet pariutuvat muihin (ei sataprosenttisesti komplementaarisiin) sekvensseihin, sekä alukedimeerien muodostuminen kasvaa, mikä johtaa alukkeiden monistumiseen. sivutuotteita.Monissa tapauksissa DNA eristetään soluviljelmistä tai mikro-organismeista ja käytetään myöhemmin PCR-templaattina.Puhdistuksen jälkeen on tarpeen määrittää DNA:n konsentraatio, jotta voidaan määrittää PCR-kokoonpanoon tarvittava tilavuus.Vaikka agaroosigeelielektroforeesi voi tarjota arvion, tämä menetelmä ei ole läheskään tarkka.UV-Vis-spektrofotometria on vakiinnutettu kultaiseksi standardiksi nukleiinihappojen kvantifiointiin;Tämä suora ja siksi helppo ja nopea menetelmä mittaa näytteen absorbanssia 260 nm:ssä ja konsentraatio lasketaan muuntokertoimen avulla.
Jos DNA:n pitoisuus on kuitenkin hyvin alhainen (< 1 µg/ml dsDNA) tai jos se on kontaminoitunut aineilla, jotka myös absorboivat 260 nm:n alueella (esim. RNA, proteiini, suolat), tämä menetelmä saavuttaa rajoituksensa.Erittäin alhaisilla pitoisuuksilla lukemat muuttuvat pian liian epätarkiksi ollakseen hyödyllisiä, ja kontaminaatiot johtavat (joskus valtavaan) todellisen arvon yliarviointiin.Tässä tapauksessa fluoresenssia käyttävä kvantifiointi voi olla vaihtoehto.Tämä tekniikka perustuu fluoresoivan väriaineen käyttöön, joka sitoutuu spesifisesti dsDNA:han, vain nukleiinihapon ja väriaineen sisältävä kompleksi viritetään valolla, ja se lähettää myöhemmin valoa, jonka aallonpituus on hieman korkeampi.Tässä fluoresoivan signaalin intensiteetti on verrannollinen DNA:n määrään, ja pitoisuuden määrittämiseksi sitä arvioidaan suhteessa standardikäyrään.Tämän menetelmän edut perustuvat sidoksen spesifisyyteen, joka sulkee pois kontaminaation aiheuttamat ulkoiset vaikutukset, sekä tuloksena olevaan kykyyn havaita erittäin pieniä DNA-pitoisuuksia.Kummankin menetelmän soveltuvuus riippuu pääasiassa näytteen pitoisuudesta ja puhtaudesta;Monissa tapauksissa voi jopa olla suositeltavaa soveltaa molempia menetelmiä rinnakkain.
Postitusaika: 30.11.2022