چه مقدار الگو باید به واکنش PCR خود اضافه کنیم؟

حتی اگر در تئوری، یک مولکول از الگو کافی است، مقادیر قابل توجهی DNA به طور معمول برای PCR کلاسیک استفاده می شود، به عنوان مثال، تا 1 میکروگرم DNA ژنومی پستانداران و کمتر از 1 pg DNA پلاسمید.مقدار بهینه تا حد زیادی به تعداد کپی های دنباله هدف و همچنین به پیچیدگی آن بستگی دارد.

اگر از الگوی بسیار کمی استفاده شود، افزایش متناظر در تعداد چرخه های تقویت برای به دست آوردن مقدار کافی محصول مورد نیاز خواهد بود.پلیمراز Taq که برای اکثر آزمایش‌های PCR استفاده می‌شود، تابع اصلاحی ندارد (فعالیت اگزونوکلئاز 3'-5).بنابراین، خطاهای رخ داده در طول تقویت را نمی توان اصلاح کرد.هرچه تعداد چرخه ها بیشتر باشد، تقویت محصول معیوب بیشتر خواهد بود.از طرف دیگر، اگر مقدار قالب خیلی زیاد باشد، احتمال بازپخت پرایمرها به توالی های دیگر (نه صد در صد مکمل) و همچنین تشکیل دایمرهای پرایمر افزایش می یابد که منجر به تقویت محصولات جانبیدر بسیاری از موارد، DNA از کشت های سلولی یا از میکروارگانیسم ها جدا شده و متعاقباً به عنوان الگوی PCR استفاده می شود.پس از خالص سازی، لازم است غلظت DNA تعیین شود تا بتوان حجم مورد نیاز برای تنظیم PCR را تعیین کرد.در حالی که الکتروفورز ژل آگارز ممکن است برای ارائه یک تخمین مفید باشد، این روش بسیار دقیق نیست.اسپکتروفتومتری UV-Vis به عنوان استاندارد طلایی برای تعیین کمیت اسیدهای نوکلئیک ایجاد شده است.این روش مستقیم و در نتیجه آسان و سریع جذب نمونه را در 260 نانومتر اندازه گیری می کند و غلظت با کمک ضریب تبدیل محاسبه می شود.

اما اگر غلظت DNA بسیار کم باشد (< 1 میکروگرم بر میلی لیتر dsDNA)، یا اگر آلوده به موادی باشد که در محدوده 260 نانومتر نیز جذب می شوند (مانند RNA، پروتئین، نمک)، این روش به محدودیت های خود خواهد رسید.در مورد غلظت های بسیار کم، قرائت ها به زودی آنقدر نادرست می شوند که قابل استفاده نباشند، و آلودگی ها منجر به تخمین بیش از حد (گاهی بسیار زیاد) ارزش واقعی می شود.در این مورد، کمی سازی با استفاده از فلورسانس ممکن است یک جایگزین باشد.این تکنیک مبتنی بر استفاده از یک رنگ فلورسنت است که به طور خاص به dsDNA متصل می شود، تنها مجموعه ای که حاوی نوکلئیک اسید است و رنگ توسط نور برانگیخته می شود و متعاقباً نوری با طول موج کمی بیشتر ساطع می کند.در اینجا، شدت سیگنال فلورسنت با مقدار DNA متناسب است و برای تعیین غلظت آن در رابطه با یک منحنی استاندارد ارزیابی می شود.مزایای این روش بر ویژگی پیوند است، که تأثیرات خارجی ناشی از آلودگی را حذف می کند، و همچنین بر توانایی حاصل برای تشخیص غلظت های بسیار پایین DNA.مناسب بودن هر دو روش عمدتاً به غلظت و خلوص نمونه بستگی دارد.در بسیاری از موارد حتی ممکن است توصیه شود که هر دو روش را به صورت موازی اعمال کنید.