Хоць тэарэтычна адной малекулы матрыцы было б дастаткова, для класічнай ПЦР звычайна выкарыстоўваецца значна большая колькасць ДНК, напрыклад, да 1 мкг геномнай ДНК млекакормячых і ўсяго 1 пг плазмидной ДНК.Аптымальная колькасць шмат у чым залежыць ад колькасці копій мэтавай паслядоўнасці, а таксама ад яе складанасці.
Калі выкарыстоўваецца вельмі мала шаблону, для атрымання дастатковай колькасці прадукту спатрэбіцца адпаведнае павелічэнне колькасці цыклаў ампліфікацыі.Палімераза Taq, якая выкарыстоўваецца для большасці эксперыментаў ПЦР, не мае функцыі карэкцыі (экзануклеазная актыўнасць 3'-5');такім чынам, памылкі, якія ўзнікаюць падчас узмацнення, не могуць быць выпраўлены.Чым большая колькасць цыклаў, тым больш распаўсюджаным будзе ўзмацненне дэфектнага прадукту.Калі, з іншага боку, колькасць шаблону занадта вялікая, верагоднасць адпалу праймераў з іншымі (не стоадсоткава кампліментарнымі) паслядоўнасцямі, а таксама адукацыя дымераў праймераў павялічыцца, што прывядзе да ўзмацнення пабочныя прадукты.У многіх выпадках ДНК вылучаюць з клеткавых культур або з мікраарганізмаў і пасля выкарыстоўваюць у якасці ПЦР-матрыцы.Пасля ачысткі неабходна вызначыць канцэнтрацыю ДНК, каб можна было вызначыць аб'ём, неабходны для ўстаноўкі ПЦР.Хоць электрафарэз у агарозным гелі можа служыць для ацэнкі, гэты метад далёкі ад дакладнасці.Спектрафатаметрыя UV-Vis была прызнана залатым стандартам для колькаснага вызначэння нуклеінавых кіслот;гэты прамы і, такім чынам, просты і хуткі метад вымярае паглынанне ўзору пры 260 нм, а канцэнтрацыя разлічваецца з дапамогай каэфіцыента пераўтварэння.
Аднак калі канцэнтрацыя ДНК вельмі нізкая (< 1 мкг/мл дцДНК) або калі яна забруджана рэчывамі, якія таксама паглынаюць у дыяпазоне 260 нм (напрыклад, РНК, бялок, солі), гэты метад дасягне сваіх абмежаванняў.У выпадку вельмі нізкіх канцэнтрацый паказанні хутка стануць занадта недакладнымі, каб быць карыснымі, а забруджвання прывядуць да (часам велізарнага) завышэння фактычнага значэння.У гэтым выпадку колькаснае вызначэнне з выкарыстаннем флуарэсцэнцыі можа стаць альтэрнатывай.Гэты метад заснаваны на выкарыстанні флуарэсцэнтнага фарбавальніка, які спецыфічна звязваецца з дцДНК, толькі комплекс, які змяшчае нуклеінавую кіслату і фарбавальнік, узбуджаецца святлом, і пасля ён будзе выпраменьваць святло крыху большай даўжыні хвалі.Тут інтэнсіўнасць флуарэсцэнтнага сігналу прапарцыйная колькасці ДНК, а для вызначэння канцэнтрацыі яна ацэньваецца ў адносінах да стандартнай крывой.Перавагі гэтага метаду грунтуюцца на спецыфічнасці сувязі, якая выключае знешнія ўздзеянні, выкліканыя забруджваннем, а таксама на выніковай здольнасці выяўляць вельмі нізкія канцэнтрацыі ДНК.Прыдатнасць любога метаду залежыць галоўным чынам ад канцэнтрацыі і чысціні ўзору;у многіх выпадках нават можа быць мэтазгодна ўжываць абодва метаду паралельна.
Час публікацыі: 30 лістапада 2022 г