Хоча теоретично однієї молекули матриці було б достатньо, для класичної ПЛР зазвичай використовується значно більша кількість ДНК, наприклад, до 1 мкг геномної ДНК ссавців і лише 1 пг плазмідної ДНК.Оптимальна кількість багато в чому залежить від кількості копій цільової послідовності, а також від її складності.
Якщо використовується дуже мала матриця, для отримання достатньої кількості продукту буде потрібно відповідне збільшення кількості циклів ампліфікації.Полімераза Taq, яка використовується для більшості експериментів ПЛР, не має функції корекції (3′-5′ екзонуклеазна активність);таким чином, помилки, що виникають під час ампліфікації, не можуть бути виправлені.Чим більша кількість циклів, тим більш поширеним буде посилення бракованого продукту.З іншого боку, якщо кількість матриці занадто велика, ймовірність відпалу праймерів з іншими (не стовідсотково комплементарними) послідовностями, а також утворення димерів праймерів збільшиться, що призведе до ампліфікації субпродукти.У багатьох випадках ДНК виділяють із клітинних культур або мікроорганізмів і згодом використовують як матрицю для ПЛР.Після очищення необхідно визначити концентрацію ДНК, щоб мати можливість визначити об’єм, необхідний для налаштування ПЛР.Хоча електрофорез у агарозному гелі може служити для оцінки, цей метод далеко не точний.Спектрофотометрія UV-Vis була встановлена як золотий стандарт для кількісного визначення нуклеїнових кислот;цей прямий і тому простий і швидкий метод вимірює поглинання зразка при 260 нм, а концентрація обчислюється за допомогою коефіцієнта перетворення.
Однак якщо концентрація ДНК дуже низька (< 1 мкг/мл дцДНК) або якщо вона забруднена речовинами, які також поглинають в діапазоні 260 нм (наприклад, РНК, білок, солі), цей метод досягне своїх обмежень.У разі дуже низьких концентрацій показання незабаром стануть занадто неточні, щоб бути корисними, а забруднення призведуть до (іноді величезного) завищення фактичного значення.У цьому випадку кількісне визначення за допомогою флуоресценції може бути альтернативою.Ця методика заснована на використанні флуоресцентного барвника, який специфічно зв’язується з дцДНК, лише комплекс, що складається з нуклеїнової кислоти та барвника, збуджується світлом, і згодом він випромінює світло з трохи вищою довжиною хвилі.Тут інтенсивність флуоресцентного сигналу пропорційна кількості ДНК, а для визначення концентрації вона оцінюється по відношенню до стандартної кривої.Переваги цього методу полягають у специфічності зв'язку, яка виключає зовнішні впливи, викликані забрудненням, а також у здатності виявляти дуже низькі концентрації ДНК.Придатність будь-якого методу залежить головним чином від концентрації та чистоти зразка;у багатьох випадках може навіть бути доцільним застосовувати обидва методи паралельно.
Час публікації: 30 листопада 2022 р