Même si en théorie, une molécule de la matrice serait suffisante, des quantités d’ADN considérablement plus importantes sont généralement utilisées pour une PCR classique, par exemple jusqu’à 1 µg d’ADN génomique de mammifère et aussi peu que 1 pg d’ADN plasmidique.La quantité optimale dépend en grande partie du nombre de copies de la séquence cible, ainsi que de sa complexité.
Si très peu de matrice est utilisée, une augmentation correspondante du nombre de cycles d’amplification sera nécessaire pour obtenir une quantité suffisante de produit.Une Taq polymérase utilisée pour la plupart des expériences PCR ne présente pas de fonction de correction (activité exonucléase 3′-5′) ;ainsi, les erreurs se produisant lors de l'amplification ne peuvent pas être corrigées.Plus le nombre de cycles est élevé, plus l’amplification du produit défectueux sera répandue.Si, d'un autre côté, la quantité de matrice est trop élevée, la probabilité d'hybridation des amorces avec d'autres séquences (non complémentaires à cent pour cent), ainsi que la formation de dimères d'amorces, augmenteront, ce qui entraînera l'amplification de sous-produits.Dans de nombreux cas, l’ADN est isolé de cultures cellulaires ou de micro-organismes et ensuite utilisé comme matrice PCR.Après purification, il est nécessaire de déterminer la concentration de l'ADN pour pouvoir définir le volume requis pour la configuration de la PCR.Bien que l’électrophorèse sur gel d’agarose puisse servir à fournir une estimation, cette méthode est loin d’être précise.La spectrophotométrie UV-Vis a été établie comme la référence en matière de quantification des acides nucléiques ;cette méthode directe et donc simple et rapide mesure l'absorbance de l'échantillon à 260 nm et la concentration est calculée à l'aide d'un facteur de conversion.
Toutefois, si la concentration d'ADN est très faible (< 1 µg/mL d'ADNdb) ou si elle est contaminée par des substances qui absorbent également dans la plage de 260 nm (par exemple ARN, protéines, sels), cette méthode atteindra ses limites.Dans le cas de concentrations très faibles, les mesures deviendront vite trop imprécises pour être utiles et les contaminations conduiront à une surestimation (parfois énorme) de la valeur réelle.Dans ce cas, la quantification par fluorescence peut présenter une alternative.Cette technique est basée sur l'utilisation d'un colorant fluorescent qui se lie spécifiquement à l'ADNdb. Seul le complexe comprenant l'acide nucléique et le colorant est excité par la lumière et émettra ensuite une lumière d'une longueur d'onde légèrement supérieure.Ici, l'intensité du signal fluorescent est proportionnelle à la quantité d'ADN et, pour déterminer la concentration, elle est évaluée par rapport à une courbe étalon.Les avantages de cette méthode reposent sur la spécificité de la liaison, qui exclut les influences extérieures introduites par la contamination, ainsi que sur la capacité qui en résulte à détecter de très faibles concentrations d'ADN.L’adéquation de l’une ou l’autre méthode dépend principalement de la concentration et de la pureté de l’échantillon ;dans de nombreux cas, il peut même être conseillé d’appliquer les deux méthodes en parallèle.
Heure de publication : 30 novembre 2022