Eĉ se en teorio, unu molekulo de la ŝablono estus sufiĉa, konsiderinde pli grandaj kvantoj de DNA estas tipe uzitaj por klasika PCR, ekzemple, ĝis 1 µg da genoma mamula DNA kaj eĉ nur 1 pg da plasmid DNA.La optimuma kvanto dependas plejparte de la nombro da kopioj de la celsekvenco, same kiel de ĝia komplekseco.
Se tre malmulte da ŝablono estas uzata, necesas responda pliiĝo en la nombro da plifortigaj cikloj por akiri sufiĉan kvanton da produkto.Taq-polimerazo kiu estas uzita por la plej multaj PCR-eksperimentoj ne havas korektan funkcion (3′-5′ eksonukleaza agado);tiel, eraroj okazantaj dum plifortigo ne povas esti korektitaj.Ju pli alta la nombro da cikloj, des pli ĝenerala estos la plifortigo de misa produkto.Se, aliflanke, la kvanto de ŝablono estas tro alta, pliiĝos la probableco de enkondukoj kalciado al aliaj (ne centprocentaj komplementaj) sekvencoj, same kiel la formado de enkondukaj dimeroj, pliiĝos, kio rezultigos la plifortigon de kromproduktoj.En multaj kazoj, DNA estas izolita de ĉelkulturoj aŭ de mikroorganismoj kaj poste utiligita kiel PCR-ŝablono.Sekvante purigon, estas necese determini la koncentriĝon de la DNA por povi difini la volumenon kiu estas postulata por la PCR-aranĝo.Dum agaroseĝelelektroforezo povas servi por disponigi takson, tiu metodo estas malproksima de preciza.UV-Vis-spektrofotometrio estis establita kiel la ora normo por la kvantigo de nukleaj acidoj;tiu rekta kaj tial facila kaj rapida metodo mezuras absorbadon de la specimeno je 260 nm, kaj koncentriĝo estas kalkulita helpe de konverta faktoro.
Se la DNA-koncentriĝo estas tamen tre malalta (< 1 µg/mL dsDNA), aŭ se ĝi estas poluita per substancoj kiuj ankaŭ sorbas en la intervalo de 260 nm (ekz. RNA, proteino, saloj), tiu metodo atingos siajn limojn.En la kazo de tre malaltaj koncentriĝoj, la valoroj baldaŭ fariĝos tro malprecizaj por esti utilaj, kaj poluadoj kondukos al (foje enorma) trotaksado de la reala valoro.En ĉi tiu kazo, kvantigo uzanta fluoreskecon povas prezenti alternativon.Tiu tekniko estas bazita sur la uzo de fluoreska tinkturfarbo kiu ligas specife al dsDNA nur la komplekso konsistanta el nuklea acido kaj tinkturfarbo estas ekscitita per la lumo, kaj ĝi poste elsendos lumon de iomete pli alta ondolongo.Ĉi tie, la intenseco de la fluoreska signalo estas proporcia al la kvanto de DNA, kaj por determini la koncentriĝon ĝi estas taksita rilate al norma kurbo.La avantaĝoj de ĉi tiu metodo ripozas sur la specifeco de la ligo, kiu ekskludas la eksterajn influojn enkondukitajn de poluado, same kiel sur la rezulta kapablo detekti tre malaltajn koncentriĝojn de DNA.La taŭgeco de ambaŭ metodoj dependas ĉefe de specimena koncentriĝo kaj pureco;en multaj kazoj eĉ povas esti konsilinde apliki ambaŭ metodojn paralele.
Afiŝtempo: Nov-30-2022