Även om det i teorin skulle vara tillräckligt med en molekyl av mallen, används vanligtvis betydligt större mängder DNA för en klassisk PCR, till exempel upp till 1 µg genomiskt däggdjurs-DNA och så lite som 1 pg plasmid-DNA.Den optimala mängden beror till stor del på antalet kopior av målsekvensen, såväl som på dess komplexitet.
Om mycket lite mall används kommer en motsvarande ökning av antalet amplifieringscykler att behövas för att erhålla en tillräcklig mängd produkt.Ett Taq-polymeras som används för de flesta PCR-experiment har ingen korrigeringsfunktion (3'-5' exonukleasaktivitet);sålunda kan fel som uppstår under förstärkning inte korrigeras.Ju högre antal cykler, desto vanligare kommer amplifieringen av den felaktiga produkten att vara.Om å andra sidan mängden mall är för hög kommer sannolikheten för att primers hybridiserar till andra (inte hundra procent komplementära) sekvenser, liksom bildningen av primerdimerer, att öka, vilket kommer att resultera i amplifiering av biprodukter.I många fall isoleras DNA från cellkulturer eller från mikroorganismer och används därefter som en PCR-mall.Efter rening är det nödvändigt att bestämma koncentrationen av DNA:t för att kunna definiera volymen som krävs för PCR-uppställningen.Även om agarosgelelektrofores kan tjäna som en uppskattning, är denna metod långt ifrån korrekt.UV-Vis-spektrofotometri har fastställts som guldstandarden för kvantifiering av nukleinsyror;denna direkta och därför lätta och snabba metod mäter absorbansen av provet vid 260 nm, och koncentrationen beräknas med hjälp av en omvandlingsfaktor.
Om DNA-koncentrationen däremot är mycket låg (< 1 µg/mL dsDNA), eller om den är förorenad med ämnen som också absorberar inom 260 nm-området (t.ex. RNA, protein, salter), kommer denna metod att nå sina begränsningar.Vid mycket låga koncentrationer kommer avläsningarna snart att bli för felaktiga för att vara användbara, och föroreningar kommer att leda till (ibland enorma) överskattningar av det faktiska värdet.I detta fall kan kvantifiering med fluorescens utgöra ett alternativ.Denna teknik är baserad på användningen av ett fluorescerande färgämne som binder specifikt till dsDNA, endast komplexet som består av nukleinsyra och färgämne exciteras av ljuset, och det kommer därefter att emittera ljus med en något högre våglängd.Här är intensiteten av den fluorescerande signalen proportionell mot mängden DNA, och för att bestämma koncentrationen utvärderas den i förhållande till en standardkurva.Fördelarna med denna metod vilar på bindningens specificitet, som utesluter de yttre påverkan som introduceras av kontaminering, såväl som på den resulterande förmågan att detektera mycket låga koncentrationer av DNA.Lämpligheten för båda metoderna beror huvudsakligen på provkoncentration och renhet;i många fall kan det till och med vara tillrådligt att tillämpa båda metoderna parallellt.
Posttid: 2022-nov-30