Kahit na sa teorya, ang isang molekula ng template ay magiging sapat, ang mas malaking halaga ng DNA ay karaniwang ginagamit para sa isang klasikong PCR, halimbawa, hanggang sa 1 µg ng genomic mammalian DNA at kasing liit ng 1 pg ng plasmid DNA.Ang pinakamainam na halaga ay higit na nakasalalay sa bilang ng mga kopya ng target na pagkakasunud-sunod, pati na rin sa pagiging kumplikado nito.
Kung napakakaunting template ang gagamitin, kakailanganin ang katumbas na pagtaas sa bilang ng mga cycle ng amplification para makakuha ng sapat na dami ng produkto.Ang Taq polymerase na ginagamit para sa karamihan ng mga eksperimento sa PCR ay hindi nagtatampok ng function ng pagwawasto (3′-5′ exonuclease na aktibidad);kaya, ang mga error na nagaganap sa panahon ng amplification ay hindi maaaring itama.Kung mas mataas ang bilang ng mga cycle, mas laganap ang pagpapalakas ng mga may depektong produkto.Kung, sa kabilang banda, ang halaga ng template ay masyadong mataas, ang posibilidad ng mga primer na pagsusubo sa iba pang (hindi isang daang porsyento na komplimentaryong) mga pagkakasunud-sunod, pati na rin ang pagbuo ng mga primer dimer, ay tataas, na magreresulta sa pagpapalakas ng by-products.Sa maraming mga kaso, ang DNA ay nakahiwalay sa mga kultura ng cell o mula sa mga mikroorganismo at pagkatapos ay ginamit bilang isang template ng PCR.Kasunod ng purification, kinakailangan upang matukoy ang konsentrasyon ng DNA upang matukoy ang volume na kinakailangan para sa PCR setup.Habang ang agarose gel electrophoresis ay maaaring magbigay ng pagtatantya, ang pamamaraang ito ay malayo sa tumpak.Ang UV-Vis spectrophotometry ay itinatag bilang pamantayang ginto para sa pag-quantification ng mga nucleic acid;ang direkta at samakatuwid ay madali at mabilis na pamamaraan ay sumusukat sa pagsipsip ng sample sa 260 nm, at ang konsentrasyon ay kinakalkula sa tulong ng isang conversion factor.
Kung ang konsentrasyon ng DNA ay napakababa, gayunpaman (< 1 µg/mL dsDNA), o kung ito ay kontaminado ng mga sangkap na sumisipsip din sa hanay na 260 nm (hal. RNA, protina, asin), maaabot ng pamamaraang ito ang mga limitasyon nito.Sa kaso ng napakababang konsentrasyon, ang mga pagbabasa ay malapit nang maging masyadong hindi tumpak upang magamit, at ang mga kontaminasyon ay hahantong sa (minsan napakalaking) overestimation ng aktwal na halaga.Sa kasong ito, ang quantification gamit ang fluorescence ay maaaring magpakita ng alternatibo.Ang pamamaraan na ito ay batay sa paggamit ng isang fluorescent dye na partikular na nagbubuklod sa dsDNA lamang ang complex na binubuo ng nucleic acid at dye ay nasasabik ng liwanag, at pagkatapos ay maglalabas ito ng liwanag na bahagyang mas mataas ang wavelength.Dito, ang intensity ng fluorescent signal ay proporsyonal sa dami ng DNA, at para sa pagtukoy ng konsentrasyon ito ay sinusuri na may kaugnayan sa isang karaniwang curve.Ang mga pakinabang ng pamamaraang ito ay nakasalalay sa pagtitiyak ng bono, na hindi kasama ang mga panlabas na impluwensya na ipinakilala ng kontaminasyon, pati na rin sa nagresultang kakayahang makita ang napakababang konsentrasyon ng DNA.Ang kaangkupan ng alinmang paraan ay higit na nakasalalay sa sample na konsentrasyon at kadalisayan;sa maraming mga kaso maaaring ito ay ipinapayong ilapat ang parehong mga pamamaraan sa parallel.
Oras ng post: Nob-30-2022