Sels hoewol yn teory ien molekule fan 'e sjabloan genôch wêze soe, wurde folle gruttere hoemannichten DNA typysk brûkt foar in klassike PCR, bygelyks oant 1 µg genomysk sûchdier-DNA en sa min as 1 pg plasmid-DNA.De optimale hoemannichte hinget foar in grut part ôf fan it oantal kopyen fan 'e doelsekwinsje, en ek op syn kompleksiteit.
As hiel lyts sjabloan wurdt brûkt, sil in oerienkommende ferheging fan it oantal fersterkingssyklusen nedich wêze om in foldwaande hoemannichte produkt te krijen.In Taq-polymerase dy't brûkt wurdt foar de measte PCR-eksperiminten hat gjin korreksjefunksje (3'-5' exonuclease-aktiviteit);sadwaande, flaters dy't foarkomme by amplification kin net korrizjearre wurde.Hoe heger it oantal syklusen, de mear foarkommende sil de fersterking fan defekt produkt wêze.As, oan 'e oare kant, it oantal sjabloanen te heech is, sil de kâns fan primers annealing nei oare (net hûndert prosint kompliminteare) sekwinsjes, lykas de foarming fan primer dimers, tanimme, wat sil resultearje yn de amplifikaasje fan byprodukten.Yn in protte gefallen wurdt DNA isolearre út selkultueren as fan mikroorganismen en wurdt dêrnei brûkt as in PCR-sjabloan.Nei suvering is it nedich om de konsintraasje fan it DNA te bepalen om it folume te kinne definiearje dat nedich is foar de PCR-opset.Hoewol agarosegelelektroforese kin tsjinje om in skatting te leverjen, is dizze metoade fier fan akkuraat.UV-Vis spektrofotometry is fêststeld as de gouden standert foar de kwantifikaasje fan nukleïnesoeren;dizze direkte en dêrom maklik en flugge metoade mjit absorbance fan de stekproef op 260 nm, en konsintraasje wurdt berekkene mei help fan in konverzje faktor.
As de DNA-konsintraasje lykwols tige leech is (< 1 µg/mL dsDNA), of as it fersmoarge is mei stoffen dy't ek opnimme yn it 260 nm-berik (bgl. RNA, proteïne, sâlten), sil dizze metoade syn beheiningen berikke.By tige lege konsintraasjes wurde de ôflêzen al gau te ûnkrekt om fan nut te wêzen, en fersmoargingen liede ta (soms enoarme) oerskatting fan de werklike wearde.Yn dit gefal kin kwantifikaasje mei fluoreszinsje in alternatyf presintearje.Dizze technyk is basearre op it brûken fan in fluorescent kleurstof dy't spesifyk bynt oan dsDNA allinnich it kompleks besteande út nucleic acid en kleurstof wurdt opwekke troch it ljocht, en it sil dêrnei emit ljocht fan in wat hegere golflingte.Hjir is de yntinsiteit fan it fluorescent sinjaal evenredich mei it bedrach fan DNA, en foar it bepalen fan de konsintraasje wurdt it evaluearre yn relaasje ta in standert kromme.De foardielen fan dizze metoade binne basearre op 'e spesifisiteit fan' e bân, dy't de eksterne ynfloeden dy't yntrodusearre wurde troch fersmoarging útslút, en ek op 'e resultearjende fermogen om heul lege konsintraasjes fan DNA te detektearjen.De geskiktheid fan beide metoade hinget benammen op stekproef konsintraasje en suverens;yn in protte gefallen kin it sels oan te rieden wêze om beide metoaden parallel oan te passen.
Post tiid: Nov-30-2022