Iako bi u teoriji jedna molekula kalupa bila dovoljna, za klasičnu PCR tipično se koriste znatno veće količine DNA, na primjer, do 1 µg genomske DNA sisavaca i samo 1 pg plazmidne DNA.Optimalna količina uvelike ovisi o broju kopija ciljne sekvence, kao i o njezinoj složenosti.
Ako se koristi vrlo malo predloška, bit će potrebno odgovarajuće povećanje u broju ciklusa amplifikacije kako bi se dobila dovoljna količina produkta.Taq polimeraza koja se koristi za većinu PCR eksperimenata nema funkciju korekcije (3'-5' egzonukleazna aktivnost);stoga se greške nastale tijekom pojačanja ne mogu ispraviti.Što je veći broj ciklusa, to će pojačanje manjkavog proizvoda biti češće.Ako je, s druge strane, količina templata prevelika, povećat će se vjerojatnost spajanja primera s drugim (ne stopostotno komplementarnim) slijedovima, kao i formiranje dimera primera, što će rezultirati amplificiranjem nusproizvodi.U mnogim slučajevima, DNA se izolira iz staničnih kultura ili iz mikroorganizama i zatim se koristi kao PCR obrazac.Nakon pročišćavanja potrebno je odrediti koncentraciju DNA kako bi se mogao definirati volumen koji je potreban za postavljanje PCR-a.Dok elektroforeza u agaroznom gelu može poslužiti za procjenu, ova metoda je daleko od točne.UV-Vis spektrofotometrija uspostavljena je kao zlatni standard za kvantifikaciju nukleinskih kiselina;ovom izravnom i stoga jednostavnom i brzom metodom mjeri se apsorbancija uzorka na 260 nm, a koncentracija se izračunava uz pomoć faktora konverzije.
Međutim, ako je koncentracija DNA vrlo niska (< 1 µg/mL dsDNA), ili ako je kontaminirana tvarima koje također apsorbiraju u rasponu od 260 nm (npr. RNA, protein, soli), ova metoda će doći do svojih ograničenja.U slučaju vrlo niskih koncentracija, očitanja će uskoro postati previše neprecizna da bi bila od koristi, a onečišćenja će dovesti do (ponekad enormnog) precjenjivanja stvarne vrijednosti.U ovom slučaju, kvantifikacija pomoću fluorescencije može predstavljati alternativu.Ova se tehnika temelji na korištenju fluorescentne boje koja se specifično veže na dsDNA samo se kompleks koji sadrži nukleinsku kiselinu i boju pobuđuje svjetlom, a zatim će emitirati svjetlost nešto veće valne duljine.Ovdje je intenzitet fluorescentnog signala proporcionalan količini DNA, a za određivanje koncentracije procjenjuje se u odnosu na standardnu krivulju.Prednosti ove metode počivaju na specifičnosti veze, koja isključuje vanjske utjecaje unesene kontaminacijom, kao i na rezultirajućoj sposobnosti detekcije vrlo niskih koncentracija DNA.Prikladnost bilo koje metode ovisi uglavnom o koncentraciji uzorka i čistoći;u mnogim slučajevima može čak biti preporučljivo primijeniti obje metode paralelno.
Vrijeme objave: 30. studenoga 2022