Auch wenn theoretisch ein Molekül der Vorlage ausreichen würde, werden für eine klassische PCR typischerweise deutlich größere DNA-Mengen verwendet, beispielsweise bis zu 1 µg genomische Säugetier-DNA und nur 1 pg Plasmid-DNA.Die optimale Menge hängt weitgehend von der Anzahl der Kopien der Zielsequenz sowie von deren Komplexität ab.
Wenn sehr wenig Template verwendet wird, ist eine entsprechende Erhöhung der Anzahl der Amplifikationszyklen erforderlich, um eine ausreichende Produktmenge zu erhalten.Eine Taq-Polymerase, die für die meisten PCR-Experimente verwendet wird, verfügt über keine Korrekturfunktion (3′-5′-Exonukleaseaktivität);Daher können Fehler, die während der Verstärkung auftreten, nicht korrigiert werden.Je höher die Anzahl der Zyklen, desto häufiger ist die Verstärkung fehlerhafter Produkte.Wenn andererseits die Menge an Matrize zu hoch ist, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass sich Primer an andere (nicht hundertprozentig komplementäre) Sequenzen anlagern, und es kommt auch zur Bildung von Primer-Dimeren, was zur Amplifikation von führt Nebenprodukte.In vielen Fällen wird DNA aus Zellkulturen oder aus Mikroorganismen isoliert und anschließend als PCR-Vorlage verwendet.Nach der Aufreinigung ist es notwendig, die Konzentration der DNA zu bestimmen, um das für den PCR-Aufbau benötigte Volumen bestimmen zu können.Während die Agarose-Gelelektrophorese zur Schätzung dienen kann, ist diese Methode alles andere als genau.Die UV-Vis-Spektrophotometrie hat sich als Goldstandard für die Quantifizierung von Nukleinsäuren etabliert;Mit dieser direkten und daher einfachen und schnellen Methode wird die Absorption der Probe bei 260 nm gemessen und die Konzentration mithilfe eines Umrechnungsfaktors berechnet.
Ist die DNA-Konzentration jedoch sehr gering (< 1 µg/mL dsDNA) oder ist sie mit Substanzen verunreinigt, die auch im 260 nm-Bereich absorbieren (z. B. RNA, Protein, Salze), stößt diese Methode an ihre Grenzen.Bei sehr geringen Konzentrationen werden die Messwerte bald zu ungenau, um noch brauchbar zu sein, und Verunreinigungen führen zu einer teilweise enormen Überschätzung des tatsächlichen Wertes.In diesem Fall kann die Quantifizierung mittels Fluoreszenz eine Alternative darstellen.Diese Technik basiert auf der Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs, der spezifisch an dsDNA bindet. Nur der Komplex aus Nukleinsäure und Farbstoff wird durch das Licht angeregt und emittiert anschließend Licht mit einer etwas höheren Wellenlänge.Dabei ist die Intensität des Fluoreszenzsignals proportional zur DNA-Menge und wird zur Konzentrationsbestimmung im Verhältnis zu einer Standardkurve ausgewertet.Die Vorteile dieser Methode liegen in der Spezifität der Bindung, die äußere Einflüsse durch Kontamination ausschließt, sowie in der daraus resultierenden Möglichkeit, auch sehr geringe DNA-Konzentrationen nachzuweisen.Die Eignung beider Methoden hängt hauptsächlich von der Konzentration und Reinheit der Probe ab;In vielen Fällen kann es sogar ratsam sein, beide Methoden parallel anzuwenden.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 30. November 2022