Edhe pse në teori, një molekulë e shabllonit do të ishte e mjaftueshme, për një PCR klasike përdoren zakonisht sasi dukshëm më të mëdha të ADN-së, për shembull, deri në 1 µg ADN gjenomike të gjitarëve dhe vetëm 1 pg ADN plazmid. Sasia optimale varet kryesisht nga numri i kopjeve të sekuencës së synuar, si dhe nga kompleksiteti i saj.
Nëse përdoret shumë pak shabllon, do të nevojitet një rritje korresponduese në numrin e cikleve të amplifikimit për të marrë një sasi të mjaftueshme të produktit. Një polimerazë Taq që përdoret për shumicën e eksperimenteve PCR nuk ka një funksion korrigjimi (aktiviteti eksonukleazë 3′-5′); kështu, gabimet që ndodhin gjatë amplifikimit nuk mund të korrigjohen. Sa më i lartë numri i cikleve, aq më i përhapur do të jetë amplifikimi i produktit me të meta. Nëse, nga ana tjetër, sasia e shabllonit është shumë e lartë, probabiliteti i kalitjes së prajmerëve në sekuenca të tjera (jo njëqind për qind plotësuese), si dhe formimi i dimerëve të prajmerëve, do të rritet, gjë që do të rezultojë në amplifikimin e nënprodukteve. Në shumë raste, ADN-ja izolohet nga kulturat qelizore ose nga mikroorganizmat dhe më pas përdoret si një shabllon PCR. Pas pastrimit, është e nevojshme të përcaktohet përqendrimi i ADN-së për të qenë në gjendje të përcaktohet vëllimi që kërkohet për konfigurimin e PCR. Ndërsa elektroforeza e xhelit të agarozës mund të shërbejë për të ofruar një vlerësim, kjo metodë është larg nga e sakta. Spektrofotometria UV-Vis është vendosur si standardi i artë për përcaktimin sasior të acideve nukleike; Kjo metodë e drejtpërdrejtë dhe për këtë arsye e lehtë dhe e shpejtë mat thithjen e mostrës në 260 nm, dhe përqendrimi llogaritet me ndihmën e një faktori konvertimi.
Nëse përqendrimi i ADN-së është shumë i ulët, megjithatë (< 1 µg/mL dsADN), ose nëse është i kontaminuar me substanca që thithin edhe në diapazonin 260 nm (p.sh. ARN, proteina, kripëra), kjo metodë do të arrijë kufizimet e saj. Në rastin e përqendrimeve shumë të ulëta, leximet shpejt do të bëhen shumë të pasakta për t'u përdorur, dhe ndotjet do të çojnë në mbivlerësim (ndonjëherë të madh) të vlerës aktuale. Në këtë rast, përcaktimi sasior duke përdorur fluoreshencën mund të paraqesë një alternativë. Kjo teknikë bazohet në përdorimin e një ngjyruesi fluoreshent që lidhet posaçërisht me dsADN-në, vetëm kompleksi që përfshin acidin nukleik dhe ngjyruesin ngacmohet nga drita, dhe më pas do të lëshojë dritë me një gjatësi vale pak më të lartë. Këtu, intensiteti i sinjalit fluoreshent është proporcional me sasinë e ADN-së, dhe për përcaktimin e përqendrimit vlerësohet në lidhje me një kurbë standarde. Avantazhet e kësaj metode mbështeten në specifikën e lidhjes, e cila përjashton ndikimet e jashtme të futura nga kontaminimi, si dhe në aftësinë që rezulton për të zbuluar përqendrime shumë të ulëta të ADN-së. Përshtatshmëria e secilës metodë varet kryesisht nga përqendrimi dhe pastërtia e mostrës; Në shumë raste, madje mund të jetë e këshillueshme që të zbatohen të dyja metodat paralelisht.
Koha e postimit: 30 nëntor 2022