Иако во теорија, една молекула од шаблонот би била доволна, за класична PCR обично се користат значително поголеми количини на ДНК, на пример, до 1 µg геномска ДНК од цицачи и само 1 pg плазмидна ДНК. Оптималната количина во голема мера зависи од бројот на копии од целната секвенца, како и од нејзината сложеност.
Доколку се користи многу малку шаблон, ќе биде потребно соодветно зголемување на бројот на циклуси на амплификација за да се добие доволна количина на производ. Taq полимеразата што се користи за повеќето PCR експерименти нема функција за корекција (3′-5′ егзонуклеазна активност); затоа, грешките што се јавуваат за време на амплификацијата не можат да се корегираат. Колку е поголем бројот на циклуси, толку е пораспространета амплификацијата на неисправниот производ. Ако, од друга страна, количината на шаблон е превисока, веројатноста за жарење на прајмерите во други (не сто проценти комплементарни) секвенци, како и формирањето на димери на прајмери, ќе се зголеми, што ќе резултира со амплификација на нуспроизводи. Во многу случаи, ДНК се изолира од клеточни култури или од микроорганизми и последователно се користи како PCR шаблон. По прочистувањето, потребно е да се одреди концентрацијата на ДНК за да може да се дефинира волуменот што е потребен за поставување на PCR. Додека електрофорезата со агарозен гел може да послужи за да се обезбеди проценка, овој метод е далеку од точен. UV-Vis спектрофотометријата е воспоставена како златен стандард за квантификација на нуклеинските киселини; Овој директен и затоа лесен и брз метод ја мери апсорпцијата на примерокот на 260 nm, а концентрацијата се пресметува со помош на фактор на конверзија.
Меѓутоа, ако концентрацијата на ДНК е многу ниска (< 1 µg/mL dsDNA), или ако е контаминирана со супстанции кои исто така се апсорбираат во опсегот од 260 nm (на пр. РНК, протеини, соли), овој метод ќе ги достигне своите ограничувања. Во случај на многу ниски концентрации, отчитувањата наскоро ќе станат премногу неточни за да бидат употребливи, а контаминациите ќе доведат до (понекогаш огромно) преценување на вистинската вредност. Во овој случај, квантификацијата со употреба на флуоресценција може да претставува алтернатива. Оваа техника се базира на употреба на флуоресцентна боја која се врзува специфично за dsDNA, само комплексот што ја содржи нуклеинската киселина и бојата е возбуден од светлината, а потоа ќе емитува светлина со малку поголема бранова должина. Тука, интензитетот на флуоресцентниот сигнал е пропорционален на количината на ДНК, а за одредување на концентрацијата се оценува во однос на стандардна крива. Предностите на овој метод се потпираат на специфичноста на врската, која ги исклучува надворешните влијанија воведени од контаминацијата, како и на добиената способност за откривање на многу ниски концентрации на ДНК. Соодветноста на кој било метод зависи главно од концентрацијата и чистотата на примерокот; во многу случаи може да биде препорачливо дури и да се применат двата методи паралелно.
Време на објавување: 30 ноември 2022 година