Anke jekk fit-teorija, molekula waħda tat-template tkun biżżejjed, ammonti konsiderevolment akbar ta' DNA jintużaw tipikament għal PCR klassiku, pereżempju, sa 1 µg ta' DNA ġenomiku tal-mammiferi u mill-inqas 1 pg ta' DNA tal-plażmidi. L-ammont ottimali jiddependi ħafna fuq in-numru ta' kopji tas-sekwenza fil-mira, kif ukoll fuq il-kumplessità tagħha.
Jekk jintuża ftit ħafna template, ikun hemm bżonn ta' żieda korrispondenti fin-numru ta' ċikli ta' amplifikazzjoni biex jinkiseb ammont suffiċjenti ta' prodott. Taq polymerase li tintuża għall-biċċa l-kbira tal-esperimenti PCR m'għandhiex funzjoni ta' korrezzjoni (attività ta' exonuclease 3′-5′); għalhekk, l-iżbalji li jseħħu waqt l-amplifikazzjoni ma jistgħux jiġu kkoreġuti. Iktar ma jkun għoli n-numru ta' ċikli, iktar tkun prevalenti l-amplifikazzjoni tal-prodott difettuż. Jekk, min-naħa l-oħra, l-ammont ta' template ikun għoli wisq, il-probabbiltà li l-primers jingħaqdu ma' sekwenzi oħra (mhux komplementari għal mija fil-mija), kif ukoll il-formazzjoni ta' dimeri tal-primer, tiżdied, u dan jirriżulta fl-amplifikazzjoni ta' prodotti sekondarji. F'ħafna każijiet, id-DNA jiġi iżolat minn kulturi taċ-ċelloli jew minn mikro-organiżmi u sussegwentement jintuża bħala template PCR. Wara l-purifikazzjoni, huwa meħtieġ li tiġi ddeterminata l-konċentrazzjoni tad-DNA biex tkun tista' tiddefinixxi l-volum li huwa meħtieġ għas-setup tal-PCR. Filwaqt li l-elettroforesi tal-ġell tal-agarose tista' sservi biex tipprovdi stima, dan il-metodu huwa 'l bogħod milli jkun preċiż. L-ispettrofotometrija UV-Vis ġiet stabbilita bħala l-istandard tad-deheb għall-kwantifikazzjoni tal-aċidi nuklejċi; Dan il-metodu dirett u għalhekk faċli u veloċi jkejjel l-assorbenza tal-kampjun f'260 nm, u l-konċentrazzjoni hija kkalkulata bl-għajnuna ta' fattur ta' konverżjoni.
Madankollu, jekk il-konċentrazzjoni tad-DNA hija baxxa ħafna (< 1 µg/mL dsDNA), jew jekk tkun ikkontaminata b'sustanzi li jassorbu wkoll fil-medda ta' 260 nm (eż. RNA, proteina, melħ), dan il-metodu jilħaq il-limitazzjonijiet tiegħu. Fil-każ ta' konċentrazzjonijiet baxxi ħafna, il-qari dalwaqt isir wisq mhux preċiż biex ikun ta' użu, u l-kontaminazzjonijiet iwasslu għal stima żejda (xi kultant enormi) tal-valur attwali. F'dan il-każ, il-kwantifikazzjoni bl-użu tal-fluworexxenza tista' tippreżenta alternattiva. Din it-teknika hija bbażata fuq l-użu ta' żebgħa fluworexxenti li torbot speċifikament mad-dsDNA, il-kumpless biss li jinkludi l-aċidu nuklejku u ż-żebgħa jiġi eċċitat mid-dawl, u sussegwentement jarmi dawl ta' wavelength kemxejn ogħla. Hawnhekk, l-intensità tas-sinjal fluworexxenti hija proporzjonali għall-ammont ta' DNA, u biex tiġi ddeterminata l-konċentrazzjoni tiġi evalwata f'relazzjoni ma' kurva standard. Il-vantaġġi ta' dan il-metodu jiddependu fuq l-ispeċifiċità tar-rabta, li teskludi l-influwenzi esterni introdotti mill-kontaminazzjoni, kif ukoll fuq il-kapaċità li tirriżulta li jinstabu konċentrazzjonijiet baxxi ħafna ta' DNA. L-adegwatezza ta' kwalunkwe metodu tiddependi prinċipalment fuq il-konċentrazzjoni u l-purità tal-kampjun; F'ħafna każijiet jista' saħansitra jkun rakkomandabbli li ż-żewġ metodi jiġu applikati b'mod parallel.
Ħin tal-posta: 30 ta' Novembru 2022