Mặc dù về mặt lý thuyết, một phân tử của khuôn mẫu sẽ là đủ, nhưng lượng DNA lớn hơn đáng kể thường được sử dụng cho PCR cổ điển, ví dụ, lên đến 1 µg DNA động vật có vú và ít nhất là 1 pg DNA plasmid. Lượng tối ưu phụ thuộc phần lớn vào số lượng bản sao của trình tự mục tiêu, cũng như vào độ phức tạp của nó.
Nếu sử dụng rất ít khuôn mẫu, cần phải tăng tương ứng số chu kỳ khuếch đại để thu được lượng sản phẩm đủ. Một Taq polymerase được sử dụng cho hầu hết các thí nghiệm PCR không có chức năng hiệu chỉnh (hoạt động exonuclease 3′-5′); do đó, các lỗi xảy ra trong quá trình khuếch đại không thể được hiệu chỉnh. Số chu kỳ càng cao, thì sự khuếch đại sản phẩm lỗi càng phổ biến. Mặt khác, nếu lượng khuôn mẫu quá cao, khả năng các đoạn mồi gắn với các trình tự khác (không phải là 100% bổ sung) cũng như sự hình thành các đoạn mồi dimer sẽ tăng lên, dẫn đến sự khuếch đại các sản phẩm phụ. Trong nhiều trường hợp, DNA được phân lập từ nuôi cấy tế bào hoặc từ vi sinh vật và sau đó được sử dụng làm khuôn mẫu PCR. Sau khi tinh chế, cần xác định nồng độ DNA để có thể xác định thể tích cần thiết cho quá trình thiết lập PCR. Mặc dù điện di gel agarose có thể giúp ước tính, nhưng phương pháp này không chính xác. Phương pháp quang phổ UV-Vis đã được xác định là tiêu chuẩn vàng để định lượng axit nucleic; phương pháp trực tiếp và dễ dàng, nhanh chóng này đo độ hấp thụ của mẫu ở bước sóng 260 nm và nồng độ được tính toán bằng hệ số chuyển đổi.
Tuy nhiên, nếu nồng độ DNA rất thấp (< 1 µg/mL dsDNA) hoặc nếu nó bị nhiễm các chất cũng hấp thụ trong phạm vi 260 nm (ví dụ RNA, protein, muối), phương pháp này sẽ đạt đến giới hạn của nó. Trong trường hợp nồng độ rất thấp, các phép đo sẽ sớm trở nên quá không chính xác để sử dụng và các chất nhiễm bẩn sẽ dẫn đến (đôi khi là rất lớn) ước tính quá cao giá trị thực tế. Trong trường hợp này, định lượng bằng huỳnh quang có thể là một giải pháp thay thế. Kỹ thuật này dựa trên việc sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết đặc hiệu với dsDNA, chỉ phức hợp bao gồm axit nucleic và thuốc nhuộm bị kích thích bởi ánh sáng và sau đó sẽ phát ra ánh sáng có bước sóng cao hơn một chút. Ở đây, cường độ tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng DNA và để xác định nồng độ, cường độ này được đánh giá theo đường cong chuẩn. Ưu điểm của phương pháp này nằm ở tính đặc hiệu của liên kết, loại trừ các ảnh hưởng bên ngoài do nhiễm bẩn gây ra, cũng như khả năng phát hiện nồng độ DNA rất thấp. Tính phù hợp của cả hai phương pháp chủ yếu phụ thuộc vào nồng độ và độ tinh khiết của mẫu; trong nhiều trường hợp, thậm chí có thể áp dụng cả hai phương pháp song song.
Thời gian đăng: 30-11-2022