Aj keď teoreticky by stačila jedna molekula templátu, pre klasickú PCR sa zvyčajne používajú podstatne väčšie množstvá DNA, napríklad až 1 µg genomickej cicavčej DNA a len 1 pg plazmidovej DNA. Optimálne množstvo závisí vo veľkej miere od počtu kópií cieľovej sekvencie, ako aj od jej komplexnosti.
Ak sa použije veľmi málo templátu, na získanie dostatočného množstva produktu bude potrebný zodpovedajúci nárast počtu amplifikačných cyklov. Taq polymeráza, ktorá sa používa vo väčšine PCR experimentov, nemá korekčnú funkciu (3′-5′ exonukleázová aktivita), preto nie je možné opraviť chyby vyskytujúce sa počas amplifikácie. Čím vyšší je počet cyklov, tým častejšia bude amplifikácia chybného produktu. Ak je však množstvo templátu príliš vysoké, zvýši sa pravdepodobnosť naviazania primerov na iné (nie stopercentne komplementárne) sekvencie, ako aj tvorba dimérov primerov, čo povedie k amplifikácii vedľajších produktov. V mnohých prípadoch sa DNA izoluje z bunkových kultúr alebo z mikroorganizmov a následne sa použije ako templát PCR. Po purifikácii je potrebné určiť koncentráciu DNA, aby bolo možné definovať objem potrebný na nastavenie PCR. Hoci elektroforéza na agarózovom géli môže slúžiť na odhad, táto metóda nie je ani zďaleka presná. UV-Vis spektrofotometria sa stala zlatým štandardom pre kvantifikáciu nukleových kyselín; Táto priama, a teda jednoduchá a rýchla metóda meria absorbanciu vzorky pri 260 nm a koncentrácia sa vypočíta pomocou konverzného faktora.
Ak je však koncentrácia DNA veľmi nízka (< 1 µg/ml dsDNA) alebo ak je kontaminovaná látkami, ktoré absorbujú aj v rozsahu 260 nm (napr. RNA, proteín, soli), táto metóda dosiahne svoje obmedzenia. V prípade veľmi nízkych koncentrácií sa hodnoty čoskoro stanú príliš nepresnými na to, aby boli použiteľné, a kontaminácie povedú k (niekedy enormnému) nadhodnoteniu skutočnej hodnoty. V tomto prípade môže alternatívou byť kvantifikácia pomocou fluorescencie. Táto technika je založená na použití fluorescenčného farbiva, ktoré sa špecificky viaže na dsDNA – iba komplex pozostávajúci z nukleovej kyseliny a farbiva je excitovaný svetlom a následne emituje svetlo s mierne vyššou vlnovou dĺžkou. Intenzita fluorescenčného signálu je v tomto prípade úmerná množstvu DNA a na určenie koncentrácie sa hodnotí vo vzťahu k štandardnej krivke. Výhody tejto metódy spočívajú v špecifickosti väzby, ktorá vylučuje vonkajšie vplyvy spôsobené kontamináciou, ako aj v výslednej schopnosti detegovať veľmi nízke koncentrácie DNA. Vhodnosť ktorejkoľvek metódy závisí hlavne od koncentrácie a čistoty vzorky; v mnohých prípadoch môže byť dokonca vhodné aplikovať obe metódy súčasne.
Čas uverejnenia: 30. novembra 2022