Selv om ett molekyl av malen i teorien ville være tilstrekkelig, brukes vanligvis betydelig større mengder DNA for en klassisk PCR, for eksempel opptil 1 µg genomisk pattedyr-DNA og så lite som 1 pg plasmid-DNA. Den optimale mengden avhenger i stor grad av antall kopier av målsekvensen, samt dens kompleksitet.
Hvis det brukes svært lite mal, vil det være nødvendig med en tilsvarende økning i antall amplifiseringssykluser for å oppnå en tilstrekkelig mengde produkt. En Taq-polymerase som brukes til de fleste PCR-eksperimenter har ikke en korreksjonsfunksjon (3'-5' eksonukleaseaktivitet); dermed kan ikke feil som oppstår under amplifisering korrigeres. Jo høyere antall sykluser, desto mer utbredt vil amplifiseringen av defekte produkter være. Hvis derimot mengden mal er for høy, vil sannsynligheten for at primere binder seg til andre (ikke hundre prosent komplementære) sekvenser, samt dannelsen av primerdimerer, øke, noe som vil resultere i amplifisering av biprodukter. I mange tilfeller isoleres DNA fra cellekulturer eller fra mikroorganismer og brukes deretter som en PCR-mal. Etter rensing er det nødvendig å bestemme konsentrasjonen av DNA for å kunne definere volumet som kreves for PCR-oppsettet. Selv om agarosegelelektroforese kan tjene til å gi et estimat, er denne metoden langt fra nøyaktig. UV-Vis-spektrofotometri er etablert som gullstandarden for kvantifisering av nukleinsyrer; Denne direkte og derfor enkle og raske metoden måler absorbansen til prøven ved 260 nm, og konsentrasjonen beregnes ved hjelp av en konverteringsfaktor.
Hvis DNA-konsentrasjonen er svært lav (< 1 µg/mL dsDNA), eller hvis den er forurenset med stoffer som også absorberer i 260 nm-området (f.eks. RNA, protein, salter), vil denne metoden nå sine begrensninger. Ved svært lave konsentrasjoner vil avlesningene snart bli for unøyaktige til å være nyttige, og forurensninger vil føre til (noen ganger enorm) overvurdering av den faktiske verdien. I dette tilfellet kan kvantifisering ved hjelp av fluorescens være et alternativ. Denne teknikken er basert på bruk av et fluorescerende fargestoff som binder seg spesifikt til dsDNA – bare komplekset som består av nukleinsyre og fargestoff eksiteres av lyset, og det vil deretter sende ut lys med en litt høyere bølgelengde. Her er intensiteten til det fluorescerende signalet proporsjonal med mengden DNA, og for å bestemme konsentrasjonen evalueres det i forhold til en standardkurve. Fordelene med denne metoden hviler på bindingens spesifisitet, som utelukker de ytre påvirkningene som introduseres av forurensning, samt på den resulterende evnen til å oppdage svært lave konsentrasjoner av DNA. Egnetheten til begge metodene avhenger hovedsakelig av prøvekonsentrasjon og renhet; I mange tilfeller kan det til og med være lurt å bruke begge metodene parallelt.
Publisert: 30. november 2022