मेरो PCR प्रतिक्रियामा हामीले कति टेम्प्लेट थप्नुपर्छ?

सिद्धान्तमा, टेम्प्लेटको एउटा अणु पर्याप्त भए पनि, क्लासिक PCR को लागि धेरै ठूलो मात्रामा DNA प्रयोग गरिन्छ, उदाहरणका लागि, १ µg सम्म जीनोमिक स्तनधारी DNA र १ pg जति थोरै प्लाज्मिड DNA। इष्टतम मात्रा धेरै हदसम्म लक्ष्य अनुक्रमको प्रतिलिपिहरूको संख्यामा, साथै यसको जटिलतामा निर्भर गर्दछ।

यदि धेरै कम टेम्प्लेट प्रयोग गरिएको छ भने, पर्याप्त मात्रामा उत्पादन प्राप्त गर्न प्रवर्धन चक्रहरूको संख्यामा समान वृद्धि आवश्यक पर्नेछ। धेरैजसो PCR प्रयोगहरूको लागि प्रयोग गरिने Taq पोलिमरेजमा सुधार प्रकार्य (3′-5′ एक्सोन्यूक्लिज गतिविधि) हुँदैन; यसरी, प्रवर्धनको समयमा हुने त्रुटिहरू सच्याउन सकिँदैन। चक्रहरूको संख्या जति बढी हुन्छ, त्रुटिपूर्ण उत्पादनको प्रवर्धन त्यति नै प्रचलित हुन्छ। यदि, अर्कोतर्फ, टेम्प्लेटको मात्रा धेरै उच्च छ भने, प्राइमरहरू अन्य (एक सय प्रतिशत पूरक होइन) अनुक्रमहरूमा एनिल हुने सम्भावना, साथै प्राइमर डाइमरहरूको गठन बढ्नेछ, जसले उप-उत्पादनहरूको प्रवर्धनमा परिणाम दिनेछ। धेरै अवस्थामा, DNA कोशिका संस्कृतिहरू वा सूक्ष्मजीवहरूबाट अलग गरिन्छ र पछि PCR टेम्प्लेटको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। शुद्धीकरण पछि, PCR सेटअपको लागि आवश्यक भोल्युम परिभाषित गर्न सक्षम हुन DNA को सांद्रता निर्धारण गर्न आवश्यक छ। जबकि agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसले अनुमान प्रदान गर्न काम गर्न सक्छ, यो विधि सही छैन। न्यूक्लिक एसिडको परिमाण निर्धारणको लागि UV-Vis स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रीलाई सुनको मानकको रूपमा स्थापित गरिएको छ; यो प्रत्यक्ष र त्यसैले सजिलो र द्रुत विधिले २६० nm मा नमूनाको अवशोषण मापन गर्दछ, र एकाग्रता रूपान्तरण कारकको मद्दतले गणना गरिन्छ।

यद्यपि, यदि DNA सांद्रता धेरै कम छ भने (< 1 µg/mL dsDNA), वा यदि यो २६० nm दायरामा पनि अवशोषित गर्ने पदार्थहरू (जस्तै RNA, प्रोटीन, लवण) ले दूषित छ भने, यो विधि यसको सीमामा पुग्नेछ। धेरै कम सांद्रताको अवस्थामा, पठनहरू चाँडै नै प्रयोगको लागि धेरै गलत हुनेछन्, र प्रदूषणले वास्तविक मूल्यको (कहिलेकाहीं अत्यधिक) अत्यधिक अनुमान निम्त्याउनेछ। यस अवस्थामा, फ्लोरोसेन्स प्रयोग गरेर परिमाणीकरणले विकल्प प्रस्तुत गर्न सक्छ। यो प्रविधि फ्लोरोसेन्ट डाईको प्रयोगमा आधारित छ जुन विशेष रूपमा dsDNA मा बाँधिन्छ केवल न्यूक्लिक एसिड र डाई समावेश गर्ने जटिल प्रकाशबाट उत्तेजित हुन्छ, र यसले पछि थोरै उच्च तरंगदैर्ध्यको प्रकाश उत्सर्जन गर्नेछ। यहाँ, फ्लोरोसेन्ट संकेतको तीव्रता DNA को मात्रासँग समानुपातिक छ, र सांद्रता निर्धारण गर्न यसलाई मानक वक्रको सम्बन्धमा मूल्याङ्कन गरिन्छ। यस विधिका फाइदाहरू बन्धनको विशिष्टतामा निर्भर गर्दछ, जसले प्रदूषणद्वारा प्रस्तुत बाह्य प्रभावहरूलाई बहिष्कार गर्दछ, साथै DNA को धेरै कम सांद्रता पत्ता लगाउने परिणामस्वरूप क्षमतामा पनि निर्भर गर्दछ। कुनै पनि विधिको उपयुक्तता मुख्यतया नमूनाको एकाग्रता र शुद्धतामा निर्भर गर्दछ; धेरै अवस्थामा दुवै विधिहरू समानान्तर रूपमा लागू गर्नु पनि उचित हुन सक्छ।