Menm si an teyori, yon molekil nan modèl la ta sifi, yo tipikman itilize kantite ADN ki pi gwo pou yon PCR klasik, pa egzanp, jiska 1 µg ADN jenomik mamifè ak osi piti ke 1 pg ADN plasmid. Kantite optimal la depann anpil de kantite kopi sekans sib la, ansanm ak konpleksite li.
Si yo itilize yon ti kantite modèl, y ap bezwen ogmante kantite sik anplifikasyon yo pou jwenn yon kantite pwodui sifizan. Yon polimeraz Taq yo itilize pou pifò eksperyans PCR pa gen yon fonksyon koreksyon (aktivite ègzonikleyaz 3′-5′); kidonk, erè ki rive pandan anplifikasyon an pa ka korije. Plis sik yo wo, se plis anplifikasyon pwodui ki defektye a ap genyen. Nan lòt men an, si kantite modèl la twò wo, pwobabilite pou amorseur yo konekte ak lòt sekans (ki pa konplemantè san pousan), ansanm ak fòmasyon dimè amorseur yo, ap ogmante, sa ki pral lakòz anplifikasyon sou-pwodui yo. Nan anpil ka, yo izole ADN nan kilti selilè oswa nan mikwo-òganis epi answit yo itilize li kòm yon modèl PCR. Apre pirifikasyon an, li nesesè pou detèmine konsantrasyon ADN nan pou kapab defini volim ki nesesè pou konfigirasyon PCR a. Pandan ke elektwoforèz jèl agaroz ka sèvi pou bay yon estimasyon, metòd sa a pa egzat ditou. Yo te etabli espektrofotometri UV-Vis kòm estanda an lò pou kantifikasyon asid nikleyik yo; Metòd dirèk sa a, ki fasil e rapid, mezire absòbans echantiyon an nan 260 nm, epi yo kalkile konsantrasyon an avèk èd yon faktè konvèsyon.
Sepandan, si konsantrasyon ADN nan trè ba (< 1 µg/mL dsDNA), oubyen si li kontamine ak sibstans ki absòbe tou nan seri 260 nm nan (pa egzanp ARN, pwoteyin, sèl), metòd sa a ap rive nan limit li yo. Nan ka konsantrasyon ki trè ba, lekti yo ap byen vit vin twò egzak pou yo itil, epi kontaminasyon yo ap mennen nan yon surestimasyon (pafwa anpil) valè reyèl la. Nan ka sa a, kantifikasyon lè l sèvi avèk fliyoresans ka prezante yon altènatif. Teknik sa a baze sou itilizasyon yon lank fliyoresans ki lye espesyalman ak dsDNA sèlman konplèks ki gen ladan asid nikleyik ak lank la eksite pa limyè a, epi li pral emèt limyè ki gen yon longèdonn yon ti kras pi wo. La a, entansite siyal fliyoresans lan pwopòsyonèl ak kantite ADN, epi pou detèmine konsantrasyon an, li evalye an relasyon ak yon koub estanda. Avantaj metòd sa a repoze sou espesifikite lyezon an, ki eskli enfliyans ekstèn ki entwodui pa kontaminasyon, ansanm ak kapasite ki kapab lakòz pou detekte konsantrasyon ADN ki trè ba. Konvenyans nenpòt metòd depann sitou sou konsantrasyon ak pite echantiyon an; Nan plizyè ka, li ka menm rekòmande pou aplike tou de metòd yo an paralèl.
Dat piblikasyon: 30 novanm 2022