Παρόλο που θεωρητικά, ένα μόριο του προτύπου θα ήταν αρκετό, για μια κλασική PCR χρησιμοποιούνται συνήθως σημαντικά μεγαλύτερες ποσότητες DNA, για παράδειγμα, έως 1 µg γονιδιωματικού DNA θηλαστικού και μόλις 1 pg πλασμιδιακού DNA. Η βέλτιστη ποσότητα εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τον αριθμό των αντιγράφων της αλληλουχίας-στόχου, καθώς και από την πολυπλοκότητά της.
Εάν χρησιμοποιηθεί πολύ λίγο πρότυπο, θα χρειαστεί αντίστοιχη αύξηση στον αριθμό των κύκλων ενίσχυσης για να ληφθεί επαρκής ποσότητα προϊόντος. Μια πολυμεράση Taq που χρησιμοποιείται για τα περισσότερα πειράματα PCR δεν διαθέτει συνάρτηση διόρθωσης (δραστικότητα εξωνουκλεάσης 3′-5′). Συνεπώς, τα σφάλματα που εμφανίζονται κατά την ενίσχυση δεν μπορούν να διορθωθούν. Όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των κύκλων, τόσο πιο συχνή θα είναι η ενίσχυση ελαττωματικού προϊόντος. Εάν, από την άλλη πλευρά, η ποσότητα του προτύπου είναι πολύ υψηλή, η πιθανότητα ανόπτησης των εκκινητών σε άλλες (όχι εκατό τοις εκατό συμπληρωματικές) αλληλουχίες, καθώς και ο σχηματισμός διμερών εκκινητών, θα αυξηθεί, γεγονός που θα οδηγήσει στην ενίσχυση των παραπροϊόντων. Σε πολλές περιπτώσεις, το DNA απομονώνεται από κυτταροκαλλιέργειες ή από μικροοργανισμούς και στη συνέχεια χρησιμοποιείται ως πρότυπο PCR. Μετά τον καθαρισμό, είναι απαραίτητο να προσδιοριστεί η συγκέντρωση του DNA για να είναι δυνατός ο καθορισμός του όγκου που απαιτείται για την προετοιμασία της PCR. Ενώ η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης μπορεί να χρησιμεύσει για να παρέχει μια εκτίμηση, αυτή η μέθοδος απέχει πολύ από το να είναι ακριβής. Η φασματοφωτομετρία UV-Vis έχει καθιερωθεί ως το χρυσό πρότυπο για την ποσοτικοποίηση των νουκλεϊκών οξέων. Αυτή η άμεση και επομένως εύκολη και γρήγορη μέθοδος μετρά την απορρόφηση του δείγματος στα 260 nm και η συγκέντρωση υπολογίζεται με τη βοήθεια ενός συντελεστή μετατροπής.
Εάν η συγκέντρωση του DNA είναι πολύ χαμηλή, ωστόσο (< 1 µg/mL dsDNA) ή εάν είναι μολυσμένο με ουσίες που απορροφώνται επίσης στην περιοχή των 260 nm (π.χ. RNA, πρωτεΐνη, άλατα), αυτή η μέθοδος θα φτάσει στα όριά της. Στην περίπτωση πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων, οι μετρήσεις σύντομα θα γίνουν πολύ ανακριβείς για να είναι χρήσιμες και οι μολύνσεις θα οδηγήσουν σε (μερικές φορές τεράστια) υπερεκτίμηση της πραγματικής τιμής. Σε αυτήν την περίπτωση, η ποσοτικοποίηση με φθορισμό μπορεί να παρουσιάσει μια εναλλακτική λύση. Αυτή η τεχνική βασίζεται στη χρήση μιας φθορίζουσας χρωστικής που συνδέεται ειδικά με το dsDNA, μόνο το σύμπλοκο που περιλαμβάνει νουκλεϊκό οξύ και χρωστική διεγείρεται από το φως και στη συνέχεια θα εκπέμπει φως ελαφρώς υψηλότερου μήκους κύματος. Εδώ, η ένταση του φθορίζοντος σήματος είναι ανάλογη με την ποσότητα του DNA και για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης αξιολογείται σε σχέση με μια πρότυπη καμπύλη. Τα πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου έγκεινται στην εξειδίκευση του δεσμού, η οποία αποκλείει τις εξωτερικές επιδράσεις που εισάγονται από τη μόλυνση, καθώς και στην προκύπτουσα ικανότητα ανίχνευσης πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων DNA. Η καταλληλότητα οποιασδήποτε από τις δύο μεθόδου εξαρτάται κυρίως από τη συγκέντρωση και την καθαρότητα του δείγματος. σε πολλές περιπτώσεις μπορεί ακόμη και να είναι σκόπιμο να εφαρμοστούν και οι δύο μέθοδοι παράλληλα.
Ώρα δημοσίευσης: 30 Νοεμβρίου 2022