Selvom ét molekyle af skabelonen i teorien ville være tilstrækkeligt, anvendes der typisk betydeligt større mængder DNA til en klassisk PCR, for eksempel op til 1 µg genomisk pattedyr-DNA og så lidt som 1 pg plasmid-DNA. Den optimale mængde afhænger i høj grad af antallet af kopier af målsekvensen samt dens kompleksitet.
Hvis der anvendes meget lidt skabelon, vil en tilsvarende stigning i antallet af amplifikationscyklusser være nødvendig for at opnå en tilstrækkelig mængde produkt. En Taq-polymerase, der anvendes til de fleste PCR-eksperimenter, har ikke en korrektionsfunktion (3'-5' exonukleaseaktivitet); derfor kan fejl, der opstår under amplifikation, ikke korrigeres. Jo højere antallet af cyklusser er, desto mere udbredt vil amplifikationen af det defekte produkt være. Hvis mængden af skabelon derimod er for høj, vil sandsynligheden for, at primere annealer til andre (ikke hundrede procent komplementære) sekvenser, samt dannelsen af primerdimerer, øges, hvilket vil resultere i amplifikation af biprodukter. I mange tilfælde isoleres DNA fra cellekulturer eller fra mikroorganismer og anvendes efterfølgende som en PCR-skabelon. Efter oprensning er det nødvendigt at bestemme DNA'ets koncentration for at kunne definere det volumen, der kræves til PCR-opsætningen. Selvom agarosegelelektroforese kan tjene til at give et estimat, er denne metode langt fra nøjagtig. UV-Vis-spektrofotometri er blevet etableret som guldstandarden for kvantificering af nukleinsyrer; Denne direkte og derfor nemme og hurtige metode måler prøvens absorbans ved 260 nm, og koncentrationen beregnes ved hjælp af en konverteringsfaktor.
Hvis DNA-koncentrationen er meget lav (< 1 µg/mL dsDNA), eller hvis den er kontamineret med stoffer, der også absorberer i 260 nm-området (f.eks. RNA, protein, salte), vil denne metode nå sine begrænsninger. I tilfælde af meget lave koncentrationer vil aflæsningerne hurtigt blive for unøjagtige til at være brugbare, og kontamineringer vil føre til (nogle gange enorm) overvurdering af den faktiske værdi. I dette tilfælde kan kvantificering ved hjælp af fluorescens være et alternativ. Denne teknik er baseret på brugen af et fluorescerende farvestof, der binder specifikt til dsDNA - kun komplekset bestående af nukleinsyre og farvestof exciteres af lyset, og det vil efterfølgende udsende lys med en lidt højere bølgelængde. Her er intensiteten af det fluorescerende signal proportional med mængden af DNA, og for at bestemme koncentrationen evalueres den i forhold til en standardkurve. Fordelene ved denne metode hviler på bindingens specificitet, som udelukker de eksterne påvirkninger, der introduceres ved kontaminering, samt på den resulterende evne til at detektere meget lave koncentrationer af DNA. Egnetheden af begge metoder afhænger hovedsageligt af prøvekoncentration og renhed; I mange tilfælde kan det endda være tilrådeligt at anvende begge metoder parallelt.
Opslagstidspunkt: 30. november 2022