கோட்பாட்டளவில், வார்ப்புருவின் ஒரு மூலக்கூறு போதுமானதாக இருந்தாலும், ஒரு கிளாசிக் PCR க்கு கணிசமாக அதிக அளவு DNA பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது, எடுத்துக்காட்டாக, 1 µg வரை மரபணு பாலூட்டி DNA மற்றும் 1 pg வரை பிளாஸ்மிட் DNA. உகந்த அளவு பெரும்பாலும் இலக்கு வரிசையின் நகல்களின் எண்ணிக்கையையும், அதன் சிக்கலான தன்மையையும் சார்ந்துள்ளது.
மிகக் குறைந்த வார்ப்புரு பயன்படுத்தப்பட்டால், போதுமான அளவு உற்பத்தியைப் பெற பெருக்க சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையில் அதற்கேற்ப அதிகரிப்பு தேவைப்படும். பெரும்பாலான PCR சோதனைகளுக்குப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு Taq பாலிமரேஸில் ஒரு திருத்தச் செயல்பாடு (3′-5′ எக்ஸோநியூக்லீஸ் செயல்பாடு) இல்லை; எனவே, பெருக்கத்தின் போது ஏற்படும் பிழைகளை சரிசெய்ய முடியாது. சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை அதிகமாக இருந்தால், குறைபாடுள்ள உற்பத்தியின் பெருக்கம் அதிகமாக இருக்கும். மறுபுறம், வார்ப்புருவின் அளவு மிக அதிகமாக இருந்தால், ப்ரைமர்கள் மற்ற (நூறு சதவீதம் இலவசம் அல்ல) வரிசைகளுக்கு அனீலிங் செய்வதற்கான நிகழ்தகவு, அதே போல் ப்ரைமர் டைமர்கள் உருவாவதும் அதிகரிக்கும், இதன் விளைவாக துணை தயாரிப்புகளின் பெருக்கம் ஏற்படும். பல சந்தர்ப்பங்களில், டிஎன்ஏ செல் கலாச்சாரங்களிலிருந்து அல்லது நுண்ணுயிரிகளிலிருந்து தனிமைப்படுத்தப்பட்டு, பின்னர் ஒரு PCR வார்ப்புருவாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. சுத்திகரிப்புக்குப் பிறகு, PCR அமைப்பிற்குத் தேவையான அளவை வரையறுக்க டிஎன்ஏவின் செறிவைத் தீர்மானிக்க வேண்டியது அவசியம். அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் ஒரு மதிப்பீட்டை வழங்க உதவும் என்றாலும், இந்த முறை துல்லியமாக இல்லை. நியூக்ளிக் அமிலங்களின் அளவீட்டிற்கான தங்கத் தரநிலையாக UV-Vis நிறமாலை ஒளி அளவியல் நிறுவப்பட்டுள்ளது; இந்த நேரடி மற்றும் எளிதான மற்றும் விரைவான முறை 260 nm இல் மாதிரியின் உறிஞ்சுதலை அளவிடுகிறது, மேலும் செறிவு ஒரு மாற்றக் காரணியின் உதவியுடன் கணக்கிடப்படுகிறது.
இருப்பினும், டிஎன்ஏ செறிவு மிகக் குறைவாக இருந்தால், (< 1 µg/mL dsDNA), அல்லது 260 nm வரம்பில் (எ.கா. ஆர்.என்.ஏ, புரதம், உப்புகள்) உறிஞ்சும் பொருட்களால் மாசுபட்டிருந்தால், இந்த முறை அதன் வரம்புகளை எட்டும். மிகக் குறைந்த செறிவுகளின் விஷயத்தில், அளவீடுகள் விரைவில் பயன்படுத்த முடியாத அளவுக்குத் துல்லியமாகிவிடும், மேலும் மாசுபாடுகள் உண்மையான மதிப்பை (சில நேரங்களில் மிகப்பெரிய) மிகைப்படுத்தலுக்கு வழிவகுக்கும். இந்த விஷயத்தில், ஃப்ளோரசன்ஸைப் பயன்படுத்தி அளவீடு செய்வது ஒரு மாற்றீட்டை வழங்கக்கூடும். இந்த நுட்பம் ஒரு ஃப்ளோரசன்ட் சாயத்தைப் பயன்படுத்துவதை அடிப்படையாகக் கொண்டது, இது குறிப்பாக டிஎஸ்டிஎன்ஏவுடன் பிணைக்கிறது, நியூக்ளிக் அமிலம் மற்றும் சாயத்தை உள்ளடக்கிய வளாகம் மட்டுமே ஒளியால் உற்சாகப்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் அது பின்னர் சற்று அதிக அலைநீளத்தின் ஒளியை வெளியிடும். இங்கே, ஃப்ளோரசன்ட் சிக்னலின் தீவிரம் டிஎன்ஏவின் அளவிற்கு விகிதாசாரமாகும், மேலும் செறிவைத் தீர்மானிப்பதற்கு இது ஒரு நிலையான வளைவுடன் தொடர்புடையதாக மதிப்பிடப்படுகிறது. இந்த முறையின் நன்மைகள் பிணைப்பின் தனித்தன்மையைச் சார்ந்துள்ளது, இது மாசுபாட்டால் அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட வெளிப்புற தாக்கங்களை விலக்குகிறது, அதே போல் டிஎன்ஏவின் மிகக் குறைந்த செறிவுகளைக் கண்டறியும் திறனையும் சார்ந்துள்ளது. இரண்டு முறைகளின் பொருத்தமும் முக்கியமாக மாதிரி செறிவு மற்றும் தூய்மையைப் பொறுத்தது; பல சந்தர்ப்பங்களில் இரண்டு முறைகளையும் இணையாகப் பயன்படுத்துவது கூட அறிவுறுத்தப்படலாம்.
இடுகை நேரம்: நவம்பர்-30-2022