Även om en enda molekyl av mallen i teorin skulle vara tillräcklig, används vanligtvis betydligt större mängder DNA för en klassisk PCR, till exempel upp till 1 µg genomiskt däggdjurs-DNA och så lite som 1 pg plasmid-DNA. Den optimala mängden beror till stor del på antalet kopior av målsekvensen, såväl som på dess komplexitet.
Om väldigt lite mall används, kommer en motsvarande ökning av antalet amplifieringscykler att behövas för att erhålla en tillräcklig mängd produkt. Ett Taq-polymeras som används för de flesta PCR-experiment saknar en korrektionsfunktion (3'-5' exonukleasaktivitet); därför kan fel som uppstår under amplifieringen inte korrigeras. Ju högre antal cykler, desto mer utbredd blir amplifieringen av den felaktiga produkten. Om mängden mall däremot är för hög, ökar sannolikheten för att primers binds till andra (inte hundra procent komplementära) sekvenser, liksom bildandet av primerdimerer, vilket resulterar i amplifiering av biprodukter. I många fall isoleras DNA från cellkulturer eller från mikroorganismer och används därefter som en PCR-mall. Efter rening är det nödvändigt att bestämma DNA:ts koncentration för att kunna definiera den volym som krävs för PCR-uppsättningen. Även om agarosgelelektrofores kan ge en uppskattning, är denna metod långt ifrån korrekt. UV-Vis-spektrofotometri har etablerats som guldstandarden för kvantifiering av nukleinsyror; Denna direkta och därför enkla och snabba metod mäter provets absorbans vid 260 nm, och koncentrationen beräknas med hjälp av en omvandlingsfaktor.
Om DNA-koncentrationen är mycket låg (< 1 µg/mL dsDNA), eller om den är kontaminerad med ämnen som också absorberar i 260 nm-området (t.ex. RNA, protein, salter), kommer denna metod att nå sina begränsningar. Vid mycket låga koncentrationer kommer avläsningarna snart att bli för felaktiga för att vara användbara, och kontamineringar kommer att leda till (ibland enorm) överskattning av det faktiska värdet. I detta fall kan kvantifiering med fluorescens vara ett alternativ. Denna teknik är baserad på användningen av ett fluorescerande färgämne som binder specifikt till dsDNA – endast komplexet bestående av nukleinsyra och färgämne exciteras av ljuset, och det kommer därefter att avge ljus med en något högre våglängd. Här är intensiteten hos den fluorescerande signalen proportionell mot mängden DNA, och för att bestämma koncentrationen utvärderas den i förhållande till en standardkurva. Fördelarna med denna metod vilar på bindningens specificitet, vilket utesluter de yttre påverkan som introduceras av kontaminering, samt på den resulterande förmågan att detektera mycket låga koncentrationer av DNA. Lämpligheten för båda metoderna beror huvudsakligen på provkoncentration och renhet; I många fall kan det till och med vara lämpligt att tillämpa båda metoderna parallellt.
Publiceringstid: 30 november 2022