Иако би у теорији један молекул шаблона био довољан, знатно веће количине ДНК се обично користе за класичну ПЦР, на пример, до 1 µг геномске ДНК сисара и само 1 pg плазмидне ДНК. Оптимална количина у великој мери зависи од броја копија циљне секвенце, као и од њене сложености.
Ако се користи врло мало шаблона, биће потребно одговарајуће повећање броја циклуса амплификације да би се добила довољна количина производа. Taq полимераза која се користи за већину PCR експеримената нема функцију корекције (3′-5′ егзонуклеазну активност); стога се грешке које се јављају током амплификације не могу исправити. Што је већи број циклуса, то ће амплификација неисправног производа бити чешћа. С друге стране, ако је количина шаблона превисока, вероватноћа спајања прајмера са другим (не сто посто комплементарним) секвенцама, као и формирање димера прајмера, ће се повећати, што ће резултирати амплификацијом нуспроизвода. У многим случајевима, ДНК се изолује из ћелијских култура или из микроорганизама и потом користи као PCR шаблон. Након пречишћавања, неопходно је одредити концентрацију ДНК да би се могла дефинисати запремина која је потребна за PCR подешавање. Иако електрофореза на агарозном гелу може послужити за процену, ова метода је далеко од тачне. UV-Vis спектрофотометрија је успостављена као златни стандард за квантификацију нуклеинских киселина; Ова директна, а самим тим и једноставна и брза метода мери апсорбанцију узорка на 260 nm, а концентрација се израчунава помоћу фактора конверзије.
Међутим, ако је концентрација ДНК веома ниска (< 1 µг/мл дцДНК), или ако је контаминирана супстанцама које такође апсорбују у опсегу од 260 нм (нпр. РНК, протеини, соли), ова метода ће достићи своја ограничења. У случају веома ниских концентрација, очитавања ће ускоро постати превише нетачна да би била употребљива, а контаминације ће довести до (понекад огромног) прецењивања стварне вредности. У овом случају, квантификација помоћу флуоресценције може представљати алтернативу. Ова техника се заснива на употреби флуоресцентне боје која се специфично везује за дцДНК - само комплекс који садржи нуклеинску киселину и боју је побуђен светлошћу, а он ће потом емитовати светлост нешто веће таласне дужине. Овде је интензитет флуоресцентног сигнала пропорционалан количини ДНК, а за одређивање концентрације се процењује у односу на стандардну криву. Предности ове методе почињу на специфичности везе, која искључује спољне утицаје уведене контаминацијом, као и на резултујућој способности детекције веома ниских концентрација ДНК. Погодност било које методе зависи углавном од концентрације и чистоће узорка; у многим случајевима чак може бити препоручљиво применити обе методе паралелно.
Време објаве: 30. новембар 2022.