Хотя теоретически одной молекулы шаблона было бы достаточно, для классической ПЦР обычно используются значительно большие объемы ДНК, например, до 1 мкг геномной ДНК млекопитающих и всего лишь 1 пг плазмидной ДНК. Оптимальное количество во многом зависит от количества копий целевой последовательности, а также от ее сложности.
Если используется очень мало матрицы, потребуется соответствующее увеличение числа циклов амплификации для получения достаточного количества продукта. Taq-полимераза, которая используется для большинства экспериментов ПЦР, не имеет функции коррекции (активность 3′-5′ экзонуклеазы); таким образом, ошибки, возникающие во время амплификации, не могут быть исправлены. Чем больше число циклов, тем более распространенной будет амплификация дефектного продукта. Если, с другой стороны, количество матрицы слишком велико, увеличится вероятность отжига праймеров с другими (не стопроцентно комплементарными) последовательностями, а также образования димеров праймеров, что приведет к амплификации побочных продуктов. Во многих случаях ДНК выделяют из клеточных культур или из микроорганизмов и впоследствии используют в качестве матрицы ПЦР. После очистки необходимо определить концентрацию ДНК, чтобы иметь возможность определить объем, необходимый для настройки ПЦР. Хотя электрофорез в агарозном геле может служить для получения оценки, этот метод далек от точности. Спектрофотометрия в УФ-видимом диапазоне была признана золотым стандартом для количественного определения нуклеиновых кислот; этот прямой, а потому простой и быстрый метод измеряет поглощение образца при 260 нм, а концентрация рассчитывается с помощью коэффициента пересчета.
Однако, если концентрация ДНК очень низкая (< 1 мкг/мл dsDNA) или если она загрязнена веществами, которые также поглощают в диапазоне 260 нм (например, РНК, белок, соли), этот метод достигнет своих ограничений. В случае очень низких концентраций показания вскоре станут слишком неточными, чтобы быть полезными, а загрязнения приведут к (иногда огромному) завышению фактического значения. В этом случае альтернативой может стать количественная оценка с использованием флуоресценции. Эта методика основана на использовании флуоресцентного красителя, который специфически связывается с dsDNA, только комплекс, включающий нуклеиновую кислоту и краситель, возбуждается светом, и впоследствии он будет излучать свет с немного большей длиной волны. Здесь интенсивность флуоресцентного сигнала пропорциональна количеству ДНК, и для определения концентрации она оценивается по отношению к стандартной кривой. Преимущества этого метода основаны на специфичности связи, которая исключает внешние влияния, вносимые загрязнением, а также на вытекающей из этого способности обнаруживать очень низкие концентрации ДНК. Пригодность любого из методов зависит в основном от концентрации и чистоты образца; во многих случаях может быть даже целесообразно применять оба метода параллельно.
Время публикации: 30 ноября 2022 г.